West Nile virus: Vaccination and pathogenesis studies in large falcons and mice

Angenvoort, Joke

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West Nile virus: Vaccination and pathogenesis studies in large falcons and mice

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Das West-Nil-Virus, ein Flavivirus, ist ein Arbovirus, welches in einem enzootischen Zyklus zwischen Mücken und Vögeln übertragen wird. Vögel sind hierbei die Reservoirwirte und verbreiten das Virus in neue Regionen. In den letzten Jahren gelangte WNV in neue geografische Regionen und ist nun endemisch auf fast allen Kontinenten der Welt. Regelmäßige Ausbrüche mit neurologischen Erkrankungen und Todesfällen von Menschen, Pferden und Vögeln treten in letzter Zeit gehäuft in Europa und in den USA auf. Greifvögel sind neben Sperlingsvögeln besonders anfällig für WNV Infektionen. Um die Pathogenität des Linie 1 Isolats (NY99) und des Linie 2 Isolats (Habicht Österreich 2009) für Großfalken zu charakterisieren, wurden je zwei Falken (Gerfalken und Hybridfalken dieser Art) mit einer niedrigen, mittleren und hohen Infektionsdosis von beiden Isolaten experimentell infiziert. Erkrankte Tiere zeigten deutliche, aber unspezifische Allgemeinsymptome, die unabhängig von der verwendeten WNV Linie waren. Alle infizierten Vögel entwickelten eine deutliche Virämie, sowie orale und kloakale Ausscheidung von WNV Genom über zwei bis drei Wochen. Eine hohe Viruslast wurde postmortal vor allem in Gehirn, Milz, Niere und Herz festgestellt. Alle infizierten Falken serokonvertierten ab Tag 6 post infectionem. Die Hauptbefunde der pathologischen Untersuchungen waren eine nichteitrige Meningoenzephalitis, nichteitrige nekrotisierende Myokarditis und Arteriitis. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass WNV hochvirulent für Großfalken ist und sie potentielle Reservoirwirte für dieses Flavivirus darstellen. Im Moment sind keine zugelassenen WNV Impfstoffe für Großfalken erhältlich. Wir untersuchten die Sicherheit, Immunogenität und Wirksamkeit von zwei kommerziell erhältlichen Pferde-Impfstoffen (Duvaxyn® WNV, inaktiviertes Vollvirus und Recombitek® rWNV, rekombinantes Kanarienpockenvirus, welches WNV prM- und E-Proteine exprimiert) und zwei experimentellen DNA-Impfstoffen (DNA-1 und DNA-2, Plasmide, die für die EProtein Ektodomänen der oben genannten Isolate der Linien 1 und 2 codieren) anhand unterschiedlicher Impfprotokolle in Großfalken (Gerfalken, Sakerfalken, Wanderfalken und Hybriden dieser Arten). Der Inaktivatimpfstoff zeigte eine gute Verträglichkeit, während der Rekombinantimpfstoff erhebliche lokale Nebenwirkungen an der Impfstelle nach sich zog. Mit beiden Impfstoffen konnte eine befriedigende Serokonversion und ein robuster Teilschutz erreicht werden, in Bezug auf Virämie, oraler und kloakaler Ausscheidung und Ausprägung klinischer Symptome, allerdings war dazu eine dreimalige intramuskuläre Applikation erforderlich. Bezüglich der Schutzwirkung zeigt der Rekombinantimpfstoff sogar ein besseres Ergebnis als der Inaktivatimpfstoff. DNA-Impfstoffe sind einfach herzustellen, stabil und sicher in der Anwendung. In Großfalken konnte nach Anwendung von DNA-1 und DNA-2 mit oder ohne nachfolgender Elektroporation oder Booster Impfung mit rekombinanter Domäne III des E-Proteins nur eine kurzfristige Serokonversion in einzelnen Vögeln erreicht werden. Die letztgenannten erweiterten Impfschemata führten zu lokalen Nebenwirkungen an der Impfstelle, jedoch ohne Störungen des Allgemeinbefindens. Die alleinige Anwendung von DNA-1 konnte Großfalken nicht effektiv gegen eine WNV Infektion schützen, wobei die Anwendung von DNA-2 eine teilweise Kreuzimmunität in Bezug auf die klinischen Symptome, Virämie und Virusausscheidung brachte. Die Kombination von DNA-1 mit Elektroporation verringerte signifikant die Höhe der Virämie, der Virusausscheidung und der Viruslast in den Organen und führte zu den besten Ergebnissen, allerdings könnten die technischen Anforderungen eine weite Anwendung in der Veterinärmedizin einschränken. Die Anwendung von Boosterimpfungen mit rekombinanter Domäne III des WNV E-Proteins konnte keine Verbesserung des Impfschutzes erreichen. Zusammengefasst ergibt sich, dass ein robuster Teilschutz von Großfalken gegen eine WNV Infektion erreicht werden kann, in Bezug auf Verringerung der Virämie, Ausscheidung und klinischer Erkrankung. Allerdings konnten eine Neuroinvasion und die dadurch bedingten neuropathologischen Alterationen durch keinen der Impfstoffe sicher verhindert werden. DNA-Impfprotokolle müssen noch weiter an Großfalken angepasst werden, um einen belastbaren Impfschutz zu bieten. Im Gegensatz zur Infektion in Großfalken unterscheiden sich die Linie 1 und 2 Isolate von WNV hinsichtlich ihrer Virulenz in Inzucht-Wildtyp-Mäusestämmen. Zur Charakterisierung des europäischen Linie 2 Isolats GO (Österreich 2009) wurde es mit bekannten hochvirulenten Linie 1 NY99 und Dakar (DA) Isolaten sowie dem avirulenten Linie 2 Isolat Uganda (UG) verglichen. Beide Linie 1 Isolate NY und DA waren hoch virulent und neuroinvasiv in einem Teil der infizierten Wildtyp-Mäuse (20 - 30% Mortalität), während die Linie 2 Isolate UG und GO apathogen waren. Im Gegensatz dazu führte die Infektion mit allen Isolaten in Typ I Interferonrezeptor knock-out Mäusen zu 100% Letalität. Hierbei erreichte das Linie 2 Isolat GO eine vergleichbar hohe Viruslast in den Organen wie die Linie 1 Isolate NY und DA, wohingegen UG niedrigere Werte erreichte. Das kürzlich in Europa verbreitete Linie 2 Isolat GO konnte die interferonbasierte Immunabwehr der Wildtypmäuse nicht überwinden, scheint jedoch weitere Virulenzfaktoren zu haben, die dem Linie 2 Isolat UG fehlen. Dennoch kann die wahrgenommene erhöhte Virulenz der Linie 2 in Europa mit den Ergebnissen dieses Nagermodells nicht erklärt werden, so dass hierbei weitere Faktoren (wie Umwelt- oder Wirtsfaktoren) dazu beigetragen haben könnten.

The flavivirus West Nile virus is an arbovirus, which is maintained in an enzootic cycle between mosquitos and birds which are the reservoir hosts and spread the virus to new regions. In recent years, WNV has spread to new geographic regions and is now endemic on almost every continent. Periodic outbreaks with neurologic disease and deaths amongst humans, equines and birds occur in Europe and the U.S. Raptors are particularly vulnerable to WNV infection, in addition to passerine species. To characterize the pathogenesis of lineage 1 NY99 isolate and lineage 2 goshawk Austria 2009 isolate for large falcons we experimentally infected two falcons each (gyrfalcons and hybrid falcons of this species) with low, intermediate and high doses of the two isolates. Diseased animals infected with both lineages showed marked, nonspecific general disease symptoms. All birds developed substantial viraemia and shedding of viral genome via the oral and cloacal route for two to three weeks. High viral loads were detected especially in brain, spleen, kidney and heart. All of the infected falcons seroconverted after WNV infection. Main pathological alterations were splenomegaly, non-suppurative myocarditis, non-suppurative meningoencephalitis and necrotizing arteritis. In conclusion, these results show that WNV is highly virulent for large falcons and that they are potential reservoir hosts for this flavivirus. No approved veterinary WNV vaccine is available for use in large falcon species. We evaluated safety, immunogenicity and efficacy of two commercial equine vaccines (Duvaxyn® WNV, inactivated whole virus and Recombitek® rWNV, recombinant canarypoxvirus expressing WNV prM an E proteins) and two DNA vaccines at research level (DNA-1 and DNA-2, plasmids coding for E protein ectodomain of lineage 1 and 2 WNV isolates) in large falcons using different vaccination protocols (gyrfalcon, saker falcon, peregrine falcon and hybrids of these species). The inactivated vaccine was tolerated well, while the recombinant vaccine revealed substantial side effects at the vaccination site. Satisfying seroconversion and robust partial protection regarding viraemia, viral shedding and clinical symptoms could be achieved, however triple application is required. Regarding protection, the recombinant vaccine was even superior to the inactivated vaccine. DNA vaccines are easy-to-produce, stable and safe vaccines. However, application of DNA-1 and DNA-2 without or with subsequent electroporation or protein boost led to only short term seroconversion in individual birds. The latter extended vaccination schemes led to local adverse reactions at the vaccination sites. Application of DNA-1 failed to protect the falcons against WNV infection, while DNA-2 provided some cross-protection regarding clinical symptoms, viraemia and viral shedding. Using DNA-1 in combination with electroporation reduced viraemia, viral shedding and organ viral load and led to the best results for DANN vaccines. However, technical requirements and the practical implication may limit the widespread veterinary use of such vaccines. Using a protein boost with recombinant domain III of WNV E protein did not substantially enhance the vaccine efficacy. In conclusion, robust partial protection of large falcons against WNV clinical disease, viraemia and viral shedding can be achieved. However, neuroinvasion and neuropathological alterations were not prevented using any of the evaluated vaccines. DNA vaccination protocols need to be further adapted to falcon species. In contrast to the findings in falcon species, WNV isolates of lineage 1 and 2 differ in virulence for inbred wild type mice. To characterize the European lineage 2 viruses, the GO Austria 2009 isolate was compared to known high virulent lineage 1 NY and DA isolates and to the nonvirulent lineage 2 isolate UG. Lineage 1 isolates NY and DA were highly virulent and neuroinvasive in a part of the infected wild type mice (20 – 30% mortality respectively), while lineage 2 isolates UG and GO were nonpathogenic. In contrast, in mice lacking type I interferon receptors all isolates led to 100% lethality and lineage 2 GO isolate reached organ viral loads as high as NY and DA, while UG remained below these isolates. The recently emerged lineage 2 isolate GO was not able to overwhelm the interferon based immune system of wild type mice, but seems to inhere virulence factors that lineage 2 isolate UG is lacking. Nonetheless the perceived high virulence of lineage 2 in Europe cannot be explained using this rodent model, suggesting that further factors (like environmental or host derived factors) might have contributed to this.