Untersuchungen zum Vorkommen von Fledermaus-assoziierten Virusinfektionen in Deutschland und zur Diagnostik und molekularen Pathogenese Flughund-assoziierter zoonotischer Paramyxoviren

Ein Ziel dieser Arbeit war die Analyse unterschiedlicher Fledermauspopulationen auf das Vorkommen von Adeno-, Corona-, Astro- und Paramyxoviren. Auf diese Weise sollten Viren mit ausreichender Prävalenz identifiziert werden, um diese in weiteren Untersuchungen als Marker für soziale Interaktionen zwischen Fledermauskolonien und Einzeltieren zu verwenden. Darüber hinaus sollte durch eine phylogenetische Einordung ein eventuelles Zoonose-Potential der gefundenen Viren eingeschätzt werden. Dafür wurde Probenmaterial von Fledermäusen aus ausgewählten Standorten molekulardiagnostisch mittels PCR untersucht sowie die Nukleinsäuresequenzen positiver Proben phylogenetisch analysiert. Auf diese Weise konnten Teilsequenzen aller gesuchten Viren gewonnen werden. Die Prävalenzen der einzelnen Viren waren hierbei sehr heterogen. Für Corona- und Adenoviren wurden durchschnittliche Prävalenzen von je 1 % festgestellt, während Astroviren abhängig von der jeweils beprobten Kolonie mit Prävalenzen von bis zu 45 % vorkamen. Damit kamen Astroviren ausreichend häufig vor, um weiterführende Untersuchungen im Hinblick auf die Übertragung zwischen den Tieren durchführen zu können. Die phylogenetischen Analysen der nachgewiesenen Adeno-, Corona-, Astro- und Paramyxoviren ergaben keine Verwandtschaft zu bekannten Pathogenen. Zur Virusisolation wurden Paramyxovirus-positive Proben schließlich auf verschiedenste eukaryotische Zelllinien appliziert, ohne jedoch eine Virusvermehrung festzustellen. Dagegen konnte aus einem infizierten embryonierten Hühnerei paramyxovirale-RNA amplifiziert werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass embryoniete Hühnereier zur Anzucht von Fledermaus-Paramyxoviren geeignet sein können. Für serologische und molekularbiologische Untersuchungen zu Henipaviren wurden polyklonale Antikörper gegen das Matrix-, das Nukleokapsid- und das Fusions-Protein sowie zusätzlich monoklonale Antikörper gegen das Matrix- und das Nukleokapsidprotein generiert. Diese Antikörper wurden durch Westernblot und Immunfluoreszenz validiert. Zusätzlich wurde ein indirekter ELISA entwickelt, der auf dem rekombinanten Nukleokapsidprotein des Hendravirus basiert. Da diese Proteine des Hendra- und des Nipahvirus serologisch kreuzreaktiv sind, sollte der ELISA zum speziesunabhängigem Nachweis beider Viren dienen. Der Test war tatsächlich in der Lage Hendra- oder Nipahvirus positive Schweine- bzw. Pferde-Seren nachzuweisen. Vereinzelt kam es zu unspezifischen Reaktionen, die bislang noch nicht unter BSL4-Bedingungen mit einem VNT überprüft werden konnten. Die Antiseren gegen das Matrix- und das Fusionsprotein kamen des Weiteren bei verschiedenen molekularbiologischen Untersuchungen zum Einsatz. Hier wurden sie in erster Linie dazu genutzt, die Expression und Verteilung der Hendraproteine in mit Plasmiden transfizierten Zellen mittels Immunfluoreszenz sichtbar zu machen. Darüber hinaus sollte die Interaktion der viralen Proteine mit dem zellulären Rezeptor, dem Ephrin B2-Liganden untersucht werden. Zur externen Steuerung aller für die Fusion der Zellmembranen und somit für die Bildung von Synzytien notwendigen Proteine wurde Ephrin B2 ebenfalls in einen Expressionsvektor kloniert. Hierbei zeigte sich eine vollständige Inhibition der Bildung von Synzytien bei Kotransfektion des Plasmides für Ephrin B2 sowohl in Rezeptor-defizienten als auch in Rezeptor-tragenden Zellen. Diesem Effekt könnte eine Überexpression des Ephrin B2-Rezeptors zugrunde liegen. Dies sollte durch weitere Versuche mit unterschiedlichen Mengen an transfiziertem Ephrin B2 überprüft werden. Daher wurden weitere Studien zur Hendra-Protein vermittelten Zellfusion in Zellen mit endogener Expression des Rezeptors durchgeführt. Hierzu wurden Zellen mit den Plasmiden für die Hendraproteine transfiziert sowie Peptide zugesetzt, die einen in der Literatur bereits beschriebenen inhibitorischen Effekt auf die Zellfusion haben. Diese Fusionsinhibition konnte in den transfizierten Zellen wie erwartet reproduziert werden. Dieses Modell zur Überprüfung der Fusionsinhibition kann in Zukunft zum Test von Therapeutika dienen, die an diesem Punkt der viralen Infektion angreifen. Um diesem Test quantifizierbare Aussagen entnehmen zu können, wurde er zu einem Luziferase-Assay erweitert. Hierbei wird das Ausmaß der Zellfusion mittels optischer Messung des Signals einer Reporter- und einer Kontroll-Luziferase bestimmt. Bei der Etablierung dieses Testes zeigte sich jedoch, dass die Expression der Kontroll-Luziferase, die eine Aussage über eine erfolgreiche Transfektion der Zellen sowie Protein-Expression geben soll, ungewünschte Abhängigkeiten zum Aktivator-Plasmid der Reporter-Luziferase aufweist. Daher bedarf dieser Test einer weiteren Optimierung, wie etwa der Wahl eines anderen Plasmides für die Kontroll-Luziferase.