Vergleichende Analyse der In-vitro-Empfindlichkeit Gram-positiver Erreger boviner Mastitiden gegenüber Tylosin mittels Bouillon-Mikrodilution und Agardiffusion
Die Mastitis des Rindes ist eine der wirtschaftlich bedeutendsten Erkrankungen in der Nutztierhaltung. Zur Therapie von Mastitiden werden in großem Umfang Antibiotika, wie das Makrolid-Antibiotikum Tylosin, auf Einzeltierebene eingesetzt. Für die Auswahl eines geeigneten Antibiotikums sind der Nachweis des ursächlichen Erregers und eine anschließende Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von großer Bedeutung. Für eine korrekte Durchführung der Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung sind anerkannte Qualitätskontrollbereiche und Beurteilungskriterien unerlässlich. Zu Beginn der Studie gab es für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung von Tylosin lediglich Qualitätskontrollkriterien vom Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) für die Bouillon-Mikrodilution und die Agardiffusion unter Verwendung von 60 µg Tylosin-Testplättchen. Üblicherweise werden aber mit 30 µg beladene Testplättchen eingesetzt. Für die In-vitro-Empfindlichkeitsprüfung gibt es zudem keine Tylosin-spezifischen Grenzwerte vom CLSI. Ein Ziel dieser Studie war es daher, Qualitätskontrollbereiche für die kommerziell verfügbaren mit 30 µg beladenen Tylosin-Testplättchen zu ermitteln. Außerdem wurden vergleichende Untersuchungen von Tylosin und Erythromycin mittels Agardiffusion und Bouillon-Mikrodilution bei Staphylokokken und Streptokokken aus Fällen von boviner Mastitis durchgeführt. Isolate mit hohen minimalen Hemmkonzentrationen (MHK-Werten) für Erythromycin wurden in der Folge auf das Vorhandensein von Makrolid-Resistenzgenen untersucht. Im Rahmen eines Ringversuchs wurde ein Qualitätskontrollbereich von 18 bis 26 mm für den Referenzstamm Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC® 25923 bei Verwendung von 30 µg Tylosin-Testplättchen im Agardiffusionsverfahren ermittelt. Dieser QC-Bereich wurde vom Unterausschuss „Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing“ des CLSI anerkannt und ersetzt nun die bisher geltenden Qualitätskontrollbereiche der mit 60 µg beladenen Tylosin-Testplättchen. Außerdem wurden 525 bovine Mastitisisolate gemäß den Vorgaben des CLSI-Dokuments VET01-A4 vergleichend mittels Bouillon-Mikrodilution und Agardiffusion auf ihre Empfindlichkeit gegenüber Tylosin und Erythromycin untersucht. Dieses Kollektiv setzte sich aus 112 S. aureus, 110 Koagulase-negativen Staphylokokken (KNS), 101 Streptococcus agalatiae (S. agalactiae), 100 Streptococcus dysgalatiae (S. dysgalactiae) und 102 Streptococcus uberis (S. uberis) zusammen. Generell zeigten die Isolate eine gute Korrelation bei den verschiedenen Methoden der Tylosin-Empfindlichkeitstestung. Dabei lagen die Isolate meist in einem MHK-Bereich von 0,12 - 4 µg/mL mit Hemmhofdurchmessern von 16 - 29 mm. In allen untersuchten Gruppen konnten auch Isolate mit verminderter Empfindlichkeit nachgewiesen werden, die MHK-Werte im Bereich von 64 - ≥256 µg/mL und fehlende Hemmhofdurchmesser aufwiesen. Bis auf elf S. uberis-Isolate, die bei der Erythromycin-Empfindlichkeitstestung als very major error klassifiziert wurden, zeigte sich eine gute Vergleichbarkeit der Ergebnisse für Tylosin und Erythromycin. Alle Isolate, die mit mindestens einer Methode als Erythromycin resistent beurteilt wurden, wurden mittels PCR auf das Vorliegen von Makrolid-Resistenzgenen geprüft. Isolate, die bei einer vorliegenden Resistenz gegenüber Erythromycin einen niedrigen MHK für Tylosin aufwiesen, wurden mittels Induktionstests auf das Vorliegen einer induzierbaren Makrolid-Resistenz untersucht. Eine Analyse der Erythromycin-resistenten Staphylokokken-Isolate mittels PCR zeigte das Vorliegen der Resistenzgene erm(A), erm(B), erm(C), erm(T), mph(C) und msr(A) alleine oder in unterschiedlichen Kombinationen. Bei den Streptokokken-Isolaten wurden die Resistenzgene erm(B), erm(C), mef(A) und msr(D) alleine oder in unterschiedlichen Kombinationen nachgewiesen. Bei insgesamt fünf Isolaten (je ein S. aureus, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus warneri, S. agalactiae und S. dysgalactiae) konnte eine induzierbare Makrolid-Resistenz nachgewiesen werden.
Bovine mastitis is one of the economically most important diseases in livestock farming. For bovine mastitis therapy, antimicrobial agents, such as the macrolide tylosin, are commonly used for individual animals. For the selection of an appropriate antibiotic, the identification of the causative pathogen and the subsequent antimicrobial susceptibility testing are needed. For correct antimicrobial susceptibility testing, approved quality control ranges and interpretive criteria are indispensable. At the beginning of this study, quality control ranges of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) were available for tylosin susceptibility testing using broth microdilution and agar disk diffusion with 60 µg disks. However, 30 µg tylosin disks are commonly used. Moreover, there are no clinical breakpoints approved by the CLSI for tylosin available. Therefore, one aim of the present study was to determine quality control ranges for the commercially available 30 µg tylosin disks. Moreover, staphylococci and streptococci from cases of bovine mastitis should comparatively be analysed for their in vitro susceptibility to tylosin and erythromycin by agar disk diffusion and broth microdilution. Isolates with high MIC values for erythromycin were screened for the presence of macrolide resistance genes. In an interlaboratory trial, a quality control range of 18 to 26 mm could be identified for the reference strain S. aureus ATCC® 25923 and 30 µg tylosin disks. The identified quality control range was approved by the CLSI subcommittee “Veterinary Antimicrobial Susceptibility Testing”. The QC range for the tylosin 30 µg disks replaced those for the tylosin 60 µg disks in the 3rd edition of the CLSI document VET01-S published in 2015. In total, 525 isolates from cases of bovine mastitis, were comparatively analysed for their tylosin and erythromycin susceptibility performed by broth microdilution and agar disk diffusion, according to the recommendations given in the CLSI document VET01-A4. This test collection comprised 112 S. aureus, 110 coagulase-negative staphylococci (CoNS), 101 Streptococcus agalatiae (S. agalactiae), 100 Streptococcus dysgalatiae (S. dysgalactiae) and 102 Streptococcus uberis (S. uberis). In general, a good correlation was seen for the results obtained with the different susceptibility testing methods. Most isolates showed MIC values of 0,12 - 4 µg/ml and zone diameters of 16 - 29 mm. In all groups, isolates with reduced susceptibility could be detected, displaying MIC values of usually 64 - ≥256 µg/ml and no inhibition zones. The comparison of the erythromycin and tylosin susceptibility testing results showed an overall good correlation, except for eleven S. uberis isolates falling into the very major error category. All isolates being classified as erythromycin-resistant by at least one method, were investigated by PCR for the presence of macrolide resistance genes. Erythromycin-resistant isolates with a low MIC value for tylosin were tested for inducible macrolide resistance by an induction test. The analysis of the erythromycin-resistant staphylococcal isolates by PCR revealed the presence of the resistance genes erm(A), erm(B), erm(C), erm(T), mph(C) and msr(A), alone or in different combinations. In case of the streptococcal isolates, the resistance genes erm(B), erm(C), mef(A) and msr(D) were detected alone or in different combinations. In total, five isolates (one isolate each of S. aureus, Staphylococccus chromogenes, Staphylococccus warneri, S. agalactiae and S. dysgalactiae) showed inducible macrolide resistance.
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