Metabolic responses of hepatic tissues on niacin treatment in dairy cows in the transition period

Kinoshita, Asako

Veröffentlicht

Metabolic responses of hepatic tissues on niacin treatment in dairy cows in the transition period

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Hintergrund: Der Glukosestoffwechsel in der Leber spielt eine wichtige Rolle für die Gesundheit und Leistung von laktierenden Milchkühen. Über 80% des Glukosebedarfs wird durch die hepatische Glukoseproduktion gedeckt. Insulin spielt eine wichtige Rolle in der Regulation des Glucosestoffwechsels. Forkhead box protein O1 (FoxO1) ist eines der Zielmoleküle von Insulin. Die durch Insulin induzierte Phosphorylierung von FoxO1 unterdrückt deren Funktion, die Transkription von Glukose-6-Phosphatase (G6P) und zytosolischem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PCK1) zu fördern. Bei Monogastriern gilt dieser Signalweg als einer der wichtigsten für die suppressiven Effekte der Insulin auf hepatische Glukose Produktion. Nicotinsäure (NA) ist ein Hauptsubstrat für die NAD-Synthese. In pharmakologischer Dose kann NA über verschiedene Mechanismen den Energiestoffwechsel beeinflussen. Neben den auf einer Interaktion mit NA-Rezeptoren basierten anti-lipolytischen Effekten, vermag NA Änderungen in der Pansenfermentation zu induzieren. Ferner sind Effekte auf das endokrinologische Profil beschrieben sowie auf die die Transkription und Posttranskription von Proteinen. Direkte Effekte von NA auf den hepatischen Glukosestoffwechsel auf molekularer Ebene sind jedoch nicht bekannt. Für diese Arbeit wurde deshalb die Hypothese aufgestellt, dass eine diätetische NA Supplementation Auswirkungen auf den hepatischen Glukosestoffwechsel von Milchkühen in der Transitperiode hat. Es wurden zwei Fütterungsversuche mit dem Ziel durchgeführt, die folgende Fragen beantworten sollten: induziert eine NA-Supplementation im hepatischen Stoffwechsel 1. Änderungen im Insulin-Signaling des Glucosestoffwechsels (Projekt 1) und 2. Änderungen der Expression/Phosphorylierung der FoxO1 und stehen diese im Zusammenhang mit Änderungen in der mRNA Expression von Schlüsselproteinen im Glucose- sowie Fettsäurestoffwechsel (Projekt 2). Material und Methoden: In beiden Projekten wurden pluripare Deutsche Holstein Milchkühe in der Ration entweder mit 0 (CON) oder 24 (NA) g/Tag NA Supplementation gefüttert. Die Kühe in den CON und NA Gruppen wurden weiter in zwei Gruppen aufgeteilt, und erhielten Rationen mit niedrigem oder hohem (30:70 oder 60:40% Kraftfutter-zu-Grundfutter-Verhältnis bezogen auf Trockenmasse) Kraftfutter-Anteil. Im Projekt 1 wurden 20 Milchkühe präpartal gleich gefüttert. Vom ersten Tag nach der Kalbung (d1) bis d21 wurden die Kühe zufällig in Fütterungsgruppen aufgeteilt und erhielten CON oder NA Rationen mit niedrigem (LCpp) oder hohem (HCpp) Kraftfutter-Anteil, so dass in den vier Gruppen jeweils fünf Versuchskühe waren. Leberbioptate - und Blutproben wurden am d-21 und d21 entnommen. Es wurden die Konzentrationen von Glukose in Plasma sowie von NEFA und Insulin im Serum gemessen. Aus deren Ergebnissen wurde der revised insulin sensitivity check index (RQUICKI) errechnet. Die Protein Expression von Insulin Rezeptor (INSR), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K), und Glukose Transporter 2 (GLUT2) wurde mit Western Blot semi-quantitative gemessen. Im Projekt 2 wurden am d-42 21 Milchkühe zufällig in Fütterungsgruppen aufgeteilt. CON oder NA Rationen wurden vom d-42 bis d24 angeboten. Ante partum, von d-42 bis d0, erhielten die Kühe Rationen mit niedrigem (LCap) oder hohem (HCap) Kraftfutter-Anteil. Am d0 wurde der Kraftfutter-Anteil für alle Kühe auf 30% eingestellt und innerhalb von 16 Tagen in der LCap Gruppe bzw. von 24 Tagen in HCap Gruppe auf 50% erhöht. Insgesamt wurden 12 Blutproben im Zeitraum d-42 bis d100 für die Bestimmung der Serumkonzentrationen von Insulin genommen. Leberbiopsien wurden am d-42, 1, 21 und 100 durchgeführt. In diesen wurde die Gesamtprotein-Expression von FoxO1 (tFoxO1) sowie das Ausmaß der Phosphorylierung von FoxO1 bei Serine 256 (pFoxO1) mittels Western blotting analysiert sowie ferner mittels real-time qPCR die mRNA Expression von Genen des hepatischen Glukosestoffwechsels und der Carnitine-Palmitoyl-Transferase 1 (CPT1A). Der Triacylglycerid-Gehalt in der Leber (TAG) wurde enzymatisch bestimmt. Die Effekte der Fütterung, der Zeit und ihrer Interaktionen wurden varianzanalytisch im Allgemeinen linearen Modell (GLM; Proteine-Expression in Projekt 1) oder im gemischten Modell (übrige Parameter) statistisch getestet. Für die Prüfung von Assoziationen zwischen Parametern wurden Pearson Korrelationen berechnet. Die Kriterien für Signifikanz und statistischen Trend wurden auf P < 0.05 und 0.1 festgelegt. Ergebnisse: Projekt 1: Im Mittel waren die Protein-Expression von GLUT2 am Tag d21 relativiert zu d-21 niedriger und die Plasma-Glukosekonzentration höher bei Kühen der NA- im Vergleichen zu denen der CON-Gruppe. Die Zeit und der Konzentratanteil in den Rationen der Versuchsgruppen hatten statistisch keine gesicherten Effekte auf die Untersuchungsparameter. Projekt 2: Die mittleren Serum-Insulinkonzentrationen waren präpartal bei Kühen der NA-Gruppe höher als bei denen der CON-Gruppe. Statistisch gesicherte Effekte der Fütterung und der Zeit auf tFoxO1, pFoxO1 und mRNA Expression von FoxO1 (rFoxO1) wurden nicht gefunden. Bei Kühen der NA-Gruppe im Vergleich zu denen der CON-Gruppe waren die mittleren mRNA Expressionen am d1 des GLUT2 und des Insulinrezeptors B niedriger und am d21 der G6P, der Propyonyl-CoA Carboxylase A und des GLUT2 höher. Positive Korrelationen zwischen pFoxO1 und Insulin sowie tFoxO1 und PCK1 wurden nur am d100 gefunden. Die mRNA Expression von FoxO1 korrelierte positiv mit der mRNA Expression von mehreren gemessenen Genen am d21 und d100. Positive Korrelationen bestanden zwischen CPT1A und G6P sowie PCK1. Schlussfolgerungen: Unabhängig vom Kraftfutter-Anteil in der Ration scheint eine diätetische NA Supplementation die Expression von GLUT2 Proteinen und die mRNA Expression von im Glukosestoffwechsel beteiligten Gene zu verändern, auch wenn die physiologische Bedeutung dieser Effekte eher klein erscheint. Die hepatische Fettsäure-Oxidation ist bei Milchkühen anscheinend positiv mit der hepatischen Glukose-Produktion assoziiert. In der Regulation der hepatischen Glukoseproduktion spielen das Insulin-Signaling und das FoxO1 bei Milchkühen in der Transitperiode offenbar zumindest auf der Ebene der Transkription, Translation und Phosphorylierung keine große Rolle. Möglich erscheint jedoch, dass FoxO1 in der späteren Laktation intensiver an der Regulation der hepatischen Glucoseproduktion beteiligt ist.

Background: Hepatic glucose metabolism is crucial for health and performance of high producing dairy cows, because more than 80% of glucose demand is covered by hepatic glucose production. Insulin has generally a suppressive effect on hepatic glucose production. Forkhead box protein O1 (FoxO1) is one of the main targets of insulin signaling. The activities of FoxO1 to promote the transcription of glucose-6-phosphatase (G6P) and cytosolic phosphoenolpyruvate carboxykinase (PCK1) are inhibited by insulin-induced phosphorylation. In monogastric species, it is one of the main pathways for the suppressive effect of insulin on hepatic gluconeogenesis. Nicotinic acid (NA), an important precursor for NAD synthesis, can affect energy metabolism through several pathways in pharmacological doses. In addition to the lipid-lowering effect based on the interaction with NA receptor, NA could modify the ruminal fermentation, endocrinal profiles, and transcriptional- and posttranscriptional regulations. However, the effects of NA on hepatic glucose metabolism in dairy cows on the molecular levels are unknown. It was hypothesized that dietary NA supplementation and concentrate proportion affected hepatic glucose metabolism in dairy cows in the transition period. Two feeding trials were conducted with aims to investigate whether the diet-induced alteration in hepatic glucose metabolism is associated with changes in hepatic insulin signaling (project 1), and whether it is associated with changes in FoxO1 expression/phosphorylation and fatty acid metabolism (project 2). Methods: In both feeding trials, pluriparous German Holstein cows were fed diets including 0 (CON) or 24 (NA) g/day NA supplementation. Cows in each NA or CON group were further divided into two groups and received diets with low or high (30:70 or 60:40 concentrate-to-roughage-ratios on dry matter (DM) basis) concentrate proportion. In project 1 20 cows were fed the same diet prepartum. From day 1 related to calving (d1) to d21, the cows were assigned randomly into feeding groups and fed CON or NA diets with low or high (LCpp or HCpp) concentrate proportions. Liver biopsy and blood samples were taken at d-21 and d21. The concentration of plasma glucose, serum NEFA, and insulin was determined and a revised quantitative insulin sensitivity check index (RQUICKI) was calculated. The protein expression of insulin receptor (INSR), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K), and glucose transporter 2 (GLUT2) was measured by Western blotting. In project 2, 21 cows were assigned into feeding groups at d-42. NA or CON diets were offered from d-42 to d24. From d-42 to d0, the cows received diets with low or high (LCap or HCap) concentrate proportions. At d0 the concentrate level in the diet was set at 30% in all the groups. It was increased up to 50% within 14 days in LCap and within 24 days in HCap. During the study period, twelve blood samples were collected for serum insulin concentration (insulin). Liver biopsies were collected at d-42, 1, 21, and 100, and analyzed for the total protein expression of FoxO1 (tFoxO1) and the extent of phosphorylation of FoxO1 at serine 256 (pFoxO1) by Western blotting, and by real-time qPCR for the mRNA expression of genes involved in glucose metabolism and of carnitine-palmitoyl-transferase 1 (CPT1A). The amount of triacylglyceride (TAG) in the liver was determined enzymatically. The effects of diet, time, and their interaction were examined using a general linear model (protein expression in project 1) or a mixed model (the other variables). Pearson’s correlation analysis was used to test the associations. The levels of significance and trend were set at P < 0.05 and 0.1, respectively. Results: In project 1, lower mean GLUT2 protein expression at d21 relative to d-21 and higher plasma glucose concentration at d21 was found in cows in NA compared with cows in CON. Neither a general time effect nor NA × concentrate interactions were found in investigated proteins. In project 2, the prepartum mean serum insulin level was higher in NA groups. Almost no time and diet effect was found in tFoxO1, pFoxO1, and mRNA expression of FoxO1 (rFoxO1). The mean mRNA expression was lower at d1 in GLUT2 and insulin receptor B and higher in G6P, propionyl-CoA carboxylase A, and GLUT2 at d21 in cows in NA compared with cows in CON. Mean hepatic TAG was highest at d1 and 21 and was generally higher in NA compared to CON. Different correlation patterns among the sampling days were found. Positive correlations of pFoxO1-insulin and tFoxO1-PCK1 were found at d100 only, while rFoxO1 correlated positively with mRNA expression of several investigated genes at d21 and 100. Positive correlations of CPT1A - G6P and CPT1A - PCK1 were found repeatedly. Conclusion: Dietary NA supplementation altered the expression of GLUT2 protein and mRNA of genes involved in energy metabolism; however, its physiological impact seemed to be small. No obvious evidence was found for the effect of concentrate proportion in the diet on the NA action on gene expression. Fatty acid oxidation was associated positively with hepatic glucose production. It appeared that the insulin signaling and FoxO1 were not the main regulators of hepatic glucose production in dairy cows in the transition period on the levels of transcription, translation, and phosphorylation. However, results indicated that FoxO1 appeared to be associated with at least a part of the regulation mechanism of hepatic glucose production in the mid-lactation.