Molekularbiologische Charakterisierung des „Bungowannah-Virus", eines außergewöhnlichen Mitgliedes des Genus Pestivirus

Richter, Maria GND

Von den bisher beschriebenen atypischen Pestiviren ist das Bungowannah-Virus das genetisch und antigenetisch am weitesten von den klassischen Pestiviren entfernte Virus-Isolat. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde das N-terminale Protease-Protein Npro des Bungowannah-Virus analysiert und charakterisiert. Es konnte die volle funktionelle Kompatibilität des Bungowannah-Virus-Npro in einem BVDV-1-Hintergrund (vCP7_Npro-Bungo) demonstriert werden. Trotz einer sehr geringen Aminosäuresequenzidentität von Bungowannah-Virus-Npro und CP7-Npro zeigten das parentale BVDV-1 CP7 sowie das neu generierte Virus vCP7_Npro-Bungo ein vergleichbares Replikationsverhalten in bovinen Zellen. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass das Bungowannah-Virus-Npro die Funktionen des CP7-Npro als Autoprotease, aber auch als Interferon-Antagonist, vollständig übernehmen kann und sich demnach trotz der großen Sequenzunterschiede nicht von den pestiviralen Npro-Proteinen der klassischen Spezies innerhalb des Genus unterscheidet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Zelltropismus des Bungowannah-Virus analysiert. Vergleichende Studien erfolgten mit ausgewählten klassischen (BVDV-1, BVDV-2) und atypischen Pestiviren (HoBi-Virus, Giraffe-Virus und Pronghorn Antilope-Virus). Dabei zeigte das Bungowannah-Virus den breitesten Zelltropismus und war im Gegensatz zu den anderen Pestiviren in der Lage, Primaten-, Fledermaus-, Human- und Mauszellen zu infizieren und dort zu replizieren. Um die Bedeutung der Virushülle für den außergewöhnlichen in vitro-Zelltropismus des Bungowannah-Virus zu untersuchen, wurde mittels heterologer Komplementierung ein chimäres rekombinantes Virus generiert, in dem die BVDV-Strukturproteine (C, Erns, E1 und E2) durch die des Bungowannah-Virus substituiert wurden (vCP7_C-E2-Bungo). Mit Hilfe der Chimäre konnte demonstriert werden, dass die Virushülle des Bungowannah-Virus allein nicht ausreicht, um den erweiterten Zelltropismus auf BVDV zu übertragen. Einzig das Bungowannah-Virus war in der Lage, effizient in Affen-, Fledermaus- und Humanzellen zu replizieren. In einigen Zelllinien (Zellen der Westlichen Grünen Meerkatze, Human- und Fledermauszellen) ist daher nicht die Virushülle allein, sondern vielmehr das Zusammenspiel des Replikationskomplexes mit den Strukturproteinen entscheidend. Die Empfänglichkeit von Fledermauszellen für das Bungowannah-Virus und die darüber hinaus erreichten hohen Virustiter in diesen Kulturen werfen die Frage nach einem möglichen Ursprung des Bungowannah-Virus in der Ordnung Chiroptera auf. Möglicherweise kam es zu einer Spill-over-Infektion und schnellen Anpassung des Erregers an Vertreter der Ordnung Artiodactyla. Da bislang keine monoklonalen Antikörper zum Nachweis von Bungowannah-Virus-Proteinen existierten, wurden am FLI neu etablierte monoklonale Antikörper auf ihre Proteinspezifität untersucht. Die Charakterisierung dieser Bungowannah-Virus-spezifischen monoklonalen Antikörper unter der Verwendung verschiedener chimärer Pestiviren erlaubte die Identifizierung von 18 Bungowannah-Virus-Erns- und einem Bungowannah-Virus-E2-spezifischen monoklonalen Antikörper. Diese sind wichtige Werkzeuge für zukünftige wissenschaftliche Untersuchungen und für die Etablierung einer einfachen und effizienten Bungowannah-Virus-Diagnostik, welche bei einem erneuten Ausbruch des Virus in australischen Schweinehaltungen oder in anderen Regionen der Welt von großer Bedeutung sein kann.

Up to now, Bungowannah virus is genetically and antigenically most divergent from the classical and atypical pestiviruses as well. As a first approach, the N-terminal Npro protein of Bungowannah virus was analyzed and characterized. The investigations revealed the functional compatibility of Bungowannah virus Npro with a BVDV type I backbone (vCP7_Npro-Bungo). Despite a very low amino acid sequence identity of Bungowannah virus-Npro and CP7-Npro, the rescued chimeric virus vCP7_Npro-Bungo was propagated efficiently in bovine cells with titers comparable to the parental BVDV-1 CP7. Furthermore, Bungowannah virus-Npro is a functional autoprotease and an active and highly efficacious IFN antagonist, and therefore does not differ from the pestiviral Npro proteins of the classical species within the genus. As a second approach, the in vitro cell tropism of Bungowannah virus was analyzed. Thereto, comparative cell culture studies were performed with selected classical (BVDV-1, BVDV-2) and atypical pestiviruses (HoBi, Giraffe and Pronghorn). The very broad in vitro tropism of Bungowannah virus differed markedly from that of the other pestiviruses. Cell lines from African green monkey, bats, human and mouse origin were permissive for Bungowannah virus, only. In order to outline the importance of the viral envelope of Bungowannah virus for its broad cell tropism, a novel chimeric virus was generated by using heterologous complementation, in which the BVDV structural proteins (C, Erns, E1 and E2) were replaced by those of Bungowannah virus (vCP7_C-E2-Bungo). However, the viral envelope was not sufficient to completely transfer the cell tropism of Bungowannah virus to a related pestivirus. Only wild type Bungowannah virus itself was able to replicate efficiently in vervet monkey, bat and human cells. Therefore, in some cell lines (of African green monkey, bat and human origin) not only the viral envelope, but rather the replication machinery together with the structural proteins is of major importance for this unique cell tropism. Since bat cells were fully susceptible to Bungowannah virus and supported the multistep growth to high titers, the hypothesis of an ancestor in bat populations has to be considered. Maybe a spillover infection occurred and Bungowannah virus quickly adapted to a member of the order Artiocatyla. Since no monoclonal antibodies for the detection of Bungowannah virus proteins existed so far, as a third and final task, a set of novel monoclonal antibodies generated at the FLI were tested for their protein specificity. The characterization of these monoclonal antibodies was carried out with different chimeric pestiviruses, and 19 monoclonal antibodies reacting specifically with Bungowannah virus were identified. Eighteen of them were specific for the Erns protein and one for the E2 protein. The newly generated monoclonal antibodies will be important tools for future scientific investigations and for the development of simple and efficient Bungowannah virus-specific diagnostic assays. This will be of major importance in the case of a reemergence of Bungowannah virus in Australian piggeries or in other parts of the world.

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Richter, Maria: Molekularbiologische Charakterisierung des „Bungowannah-Virus", eines außergewöhnlichen Mitgliedes des Genus Pestivirus. Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät 2016.

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