Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Interakteure der Rabiesvirus Polymerase und des Hendravirus Matrixproteins

Bauer, Anja GND

In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Interaktion der Rabiesvirus Polymerase L und des Hendravirus Matrixproteins M mit zellulären Proteinen und intrazellulären Strukturen durchgeführt. Mit ASS1 und DLC1 wurden zwei zelluläre Proteine identifiziert, die direkt oder indirekt mit der Rabiesvirus Polymerase L interagieren. Zellkulturuntersuchungen zum Einfluss von ASS1 auf die Rabiesvirus Replikation lieferten bisher keinen Hinweis auf eine Beeinflussung der Polymerasefunktionen und die Diskussion möglicher Mechanismen einer Interferenz mit der NO-Synthese in infizierten Organismen blieb spekulativ. Für DLC1 wurde erstmals gezeigt, dass das L Protein des Rabiesvirus ein Konsensusmotiv für die Bindung von DLC1 enthält und die Effizienz der viralen Primärtranskription durch die Anwesenheit dieses Motivs beeinflusst wird. Vergleichende Untersuchungen mit Virusmutanten, in denen das in L identifizierte Motiv und ein bereits beschriebenes DLC1-bindendes Motiv in P mutiert waren, zeigten, dass beide Motive in vergleichbarer Weise die virale Primärtranskription beeinflussen. Die Kombination entsprechender Mutationen hatte jedoch keinen additiven Effekt auf die Polymeraseaktivität. Für die Funktionalität des Rabiesvirus Polymerasekomplexes P/L im Rahmen der viralen Primärtranskription scheint eine Interaktion mit beiden Komponenten des Komplexes erforderlich zu sein. Quantitative Analysen zur Verteilung von in die Zelle eingedrungenen Viruspartikeln zeigten, dass eine Akkumulierung viraler Ribonukleoproteine (RNP) nur in Anwesenheit des DLC1 Motivs in P erfolgte, und dass dies unabhängig von Mutationen in L war. Dies deutete darauf hin, dass die P-abhängige Akkumulierung von RNPs in frühen Phasen der Virusinfektion und die P und L abhängige Steigerung der Primärtranskription zwei funktionell voneinander trennbare Prozesse sind. Neben der DLC1 abhängigen Regulation der viralen Primärtranskription zeigten Untersuchungen zur Regulation der DLC1 Mengen in virusinfizierten Zellkulturen, dass die zelluläre DLC1 Genexpression durch die Anwesenheit der DLC1 Motive in P und in L reguliert wird. Diese Erkenntnisse und neuere Erkenntnisse zur Autoregulation der DLC1 Genexpression zeigen, dass die Bindung von DLC1 an beide Proteine des P/L Polymerasekomplexes, sowie die Retention von DLC1 in viralen Inclusion Bodies vermutlich die Verfügbarkeit an freiem DLC1 limitiert, und damit eine DLC1 abhängige Inhibition des DLC1 Genexpression regulierenden Transkriptionsfaktors ASCIZ aufhebt. Inwieweit dieses Modell einer virusabhängigen DLC1 Regulation zutrifft, weitere über einen derartigen Mechanismus regulierte Zellgene betroffen sind und diese einen Einfluss auf die Virusreplikation haben, müssen weiterführende Untersuchungen zeigen. Darüber hinaus wurde mittels Fluoreszenzprotein-markiertem L von Rabies- und verwandten Lyssaviren erstmals gezeigt, dass die virale Polymerase an Mikrotubuli akkumuliert und diese reorganisiert. Die Abhängigkeit der Mikrotubuli-Lokalisation von einem intakten DLC1 Motiv in L deutete darauf hin, dass DLC1 ein Faktor bei der Rekrutierung von L an die Mikrotubuli ist. Auch für das Hendravirus M-Protein wurden mittels Affinitätschromatographie und Analyse von M haltigen Proteinkomplexen potentielle Interaktionspartner identifiziert. Dabei zeigte sich, dass nukleäres ANP32B Hendravirus M entweder direkt oder indirekt bindet. Aufgrund einer ANP32B-abhängigen Kernretention von M und der hier gezeigten Analysen zur Interaktion dieser Proteine, kann davon ausgegangen werden, dass ANP32B eine nukleäre Zielstruktur für das Hendravirus M darstellt. Ebenso kann davon ausgegangen werden, dass die Interaktion entweder direkt die Virusreplikation oder pro oder antiviral wirkende Mechanismen der Wirtszelle beeinflusst. Im Hinblick auf Funktionen von ANP32B beim Crm1 vermittelten Kernexport von mRNAs, der Regulation der zellulären Genexpression und der Apoptoseregulation erscheint eine weiterführende funktionelle Charakterisierung der entsprechenden ANP32B abhängigen Mechanismen sinnvoll. Auch wenn die Rolle von ANP32B im Replikationszyklus von Hendraviren noch nicht geklärt ist, zeigten Untersuchungen mit M Proteinen anderer Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus und Bovines Respiratorisches Synzytialvirus), dass die Interaktion mit ANP32B in mindestens zwei unterschiedlichen Virusgattungen innerhalb der Unterfamilie der Paramyxovirinae konserviert ist. Daher wird angenommen, dass die Interaktion mit ANP32B Teil eines bei Paramyxoviren konservierten Mechanismus ist. Zusammenfassend wurde mit den in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung von wirtszellabhängigen Funktionen viraler Proteine geleistet. Mit der Identifizierung von zellulären Zielproteinen der Rabiesvirus Polymerase und paramyxoviraler Matrixproteine wurde eine wichtige Grundlage für weiterführende Arbeiten zu den involvierten molekularen Mechanismen und deren Relevanz im infizierten Wirt geschaffen.

In this study, interactions of Rabies virus polymerase L and Hendra virus matrix protein M with cellular proteins and intracellular structures have been investigated. With ASS1 and DLC1, two cellular proteins have been identified that either directly or indirectly interact with the enzymatically active subunit L of the Rabies virus (RABV) polymerase complex. Cell culture based assays did not indicate any influence of ASS1 on RABV replication and a discussion about possible interference with nitric oxid synthesis in infected organisms remained theoretical. However, it was shown for the first time, that the L protein contains a consensus binding motif for DLC1 and that this motif has an impact on efficient viral primary transcription. Moreover, comparative studies with virus mutants in which the identified motif in L and the already described DLC1-binding motif in P have been mutated, showed that both motifs influence primary transcription of the virus in a comparable manner. However, a combination of both mutations had no additive effect on the polymerase activity. Because of these data it was hypothesized that functionality of the polymerase complex P/L in primary transcription depends on an interaction of DLC1 with both components of the RABV polymerase complex. Quantitative analysis of the distribution of virus particles after penetration of cells showed, that an accumulation of viral ribonucleoproteins (RNP) depended on the presence of an intact DLC1-binding motif in P and that the accumulation was not affected by mutations in the DLC1-binding motif of L. These data indicated that the P-dependent accumulation of RNPs in early phases of the infection and the P- and L-dependent stimulation of primary transcription represent two functionally separable processes. In addition to the DLC1-dependent viral primary transcription, analysis of intracellular DLC1 level regulation in virus infected cell cultures revealed, that the cellular DLC1 gene expression was regulated by the DLC1-binding motifs in P and L. Because of the observed regulation and based on novel insights into autoregulation of DLC1 gene expression, it was assumed that binding of DLC1 to both virus proteins of the P/L polymerase complex and retention of DLC1 in cytoplasmic viral inclusion bodies, limits the level of free cytoplasmic DLC1. Limiting DLC1 levels could result in the loss of DLC1-dependent inhibition of transcription factor ASCIZ and subsequent ASCIZ-dependent DLC1 gene expression. Further studies have to show whether this model of virus-dependent DLC1 regulation can be confirmed and whether other ASCIZ regulated cell genes are affected. Moreover, for the first time it was shown by fluorescence tagged L protein of Rabies and related lyssaviruses, that the viral polymerase accumulates at microtubules and reorganizes the tubulin cytoskeleton. Dependence of microtubule localization on an intact DLC1 binding motif in L indicated that DLC1 is one factor involved in the recruitment of L to microtubules. Also the Hendra virus M protein was purified by affinity chromatography and analysis of M containing protein complexes led to the identification of potential interaction partners. The nuclear protein ANP32B either directly or indirectly bound HeV M. The interaction of HeV M and ANP32B shown here, and a ANP32B dependent retention of HeV M in the nucleus, support the assumption that ANP32B is a nuclear target of HeV M and that this interaction either directly influences viral replication or pro- or antiviral host cell mechanisms. In view of known functions of ANP32B in Crm1 dependent nuclear export of mRNAs, regulation of cellular gene expression and regulation of apoptosis further investigations are required to characterize such ANP32B dependent mechanisms. Although the relevance of ANP32B for the life cycle of Hendra virus is not yet clarified, studies with M proteins of paramyxoviruses Newcastle disease virus and bovine respiratory syncytial virus showed, that the interaction with ANP32B is conserved in at least two genera of the Paramyxovirinae subfamily and it is supposed that interaction with ANP32B is part of a conserved mechanism among paramyxoviruses. In summary these results contribute to the elucidation of host cell dependent functions of viral proteins. The identification of cellular target proteins of Rabies virus polymerase and of Hendra virus matrix protein provides an essential basis for the further investigation of molecular mechanisms and their relevance in the infected host.

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Bauer, Anja: Identifizierung und Charakterisierung zellulärer Interakteure der Rabiesvirus Polymerase und des Hendravirus Matrixproteins. Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Abteilung für Mikrobiologie und Molekularbiologie 2015.

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