Detection of Y-chromosome bearing bovine sperm using laser-generated gold nanoparticle bio-conjugates

Diese Studie beschreibt zwei innovative Aspekte der molekularen Biologie, Triplex-bildende Oligonukleotide (TFOs) allein und konjugiert mit Gold-Nanopartikeln. Ziel der Arbeit war es, eine neue Methode für die spezifische Genommodifikation von Spermien und deren Anwendbarkeit beim Sperma-Sexing zu entwickeln, die auf der Lebend-Detektion von Gensequenzen basiert. Neben der Nutzung anderer DNA-detektierender Marker stellen Triplex-bildende Oligonukleotide eine alternative Methode für die spezifische Gendetektion in vitalen Zellen dar. Das Gelingen der Triplex-basierten Chromosomen-Markierung wird durch die Bindung spezifischer Oligonukleotide erzielt. In dieser Arbeit wurden mehrere Zielsequenzen für Triplex-Sonden auf dem bovinen Y-Chromosomen gefunden. Damit ist die Triplex-Hybridisierung auch für die Detektion von Y-Chromosomen-tragende Spermien eine zuverlässige Methode . Drei ausgewählte TFOs, die eine Länge von circa 20 Basen aufwiesen, wurden in Hinblick auf ihre Hybridisierungseffizienz mit bovinen Y-Chromosomen analysiert. Eine bessere Hybridisierungsfähigkeit der Triplex-Sonden wurde durch die simultane Nutzung mehrerer Sonden erreicht. Nicht alle Y-Chromosome tragenden Spermien konnten mit TFOs markiert werden. Dieses ist höchstwahrscheinlich auf den DNA-Kondensierungsrad zurückzuführen. Diese Studie bestätigt, dass für TFOs mit niedrigem Cytosingehalt eine höhere Hybridisierungstemperatur notwendig ist. Um das Hybridisierungspotential von TFOs für zukünftige Studien festzulegen, ist es nötig, weitere Variablen zu berücksichtigen, beispielsweise die Koinkubationszeit für die Ziel-DNA mit den TFO-Sonden, die Inkubationstemperatur, die Sequenz der TFOs und ihr Methylcytosingehalt, die Art der Puffer und individuelle Sequenzvariationen zwischen verschiedenen Bullen. Gold-Nanopartikel, die mit TFOs konjugiert sind, können mit genomischer DNA, die frei in Lösung ist, hybridisieren und führen zu einer Plasmon-Resonanz-Verschiebung (SPR). Die Anwendung dieser Konjugate mit Spermienchromatin führte nicht zu einem signifikanten Signalunterschied. Weitere Studien sind nötig, um Konjugate mit Gold Nanopartikeln verschiedener Größe (2 bis 50 nm) und ihre mögliche Anwendbarkeit für kondensierte Chromatinstrukturen zu identifizieren.