Molecular evolution of the bank vole-borne Puumala hantavirus in Central Europe

Sheikh Ali, Hanan

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Molecular evolution of the bank vole-borne Puumala hantavirus in Central Europe

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Hantaviruses are initially thought to be rodent-borne pathogens, recently novel hantaviruses have been discovered in shrews, moles and bats. The genome of hantaviruses consists of three genome segments, small (S), medium (M) and large (L) segments. Currently, only certain rodent-borne hantaviruses are known to be pathogenic to human. Puumala virus (PUUV) is causing a mild to moderate course of Haemmorhagic fever with renal syndrome in Europe, with an average of 10,000 human cases reported annually. The main host of PUUV is the bank vole (Clethrionomys glareolus), a cricetide rodent distributed in almost all parts of Europe. The study aimed to develop tools for a parallel analysis of the phylogeography of PUUV and the bank vole in Central Europe, and Germany in particular, on a large and small geographical scale. Therefore, novel methods for molecular rodent species identification and bank vole lineage discrimination as well as for the molecular differentiation of PUUV strains should be established. A novel molecular assay using cytochrome b (cyt b) gene-derived degenerated primers was developed for molecular identification of small mammals. The assay was validated for small mammals in Germany comprising representatives of the orders like Rodentia, Soricomorpha, Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora and Chiroptera. Thereafter, this method was successfully applied for small mammal specimens from other parts of Europe, Asia and Africa. In addition, the novel assay also was used to differentiate the genetic bank vole lineages in Central Europe. In north-eastern Poland bank voles belong to the Carpathian and Eastern lineages. The investigation of bank voles from Germany revealed the presence of three different lineages, the Western, Eastern and Carpathian lineage with different, but partially overlapping distribution in Germany. Future studies have to prove the distribution of the different bank vole lineages in more details to understand their recolonization routes in Europe and the pathogen association. The first complete genome sequence of a PUUV strain from Central Europe was determined by a combination of a primer-walking and RNA ligation approach. The length of the S, M and L segments of the bank vole-derived PUUV strain from Astrup, Lower Saxony, were found to be 1,828, 3,680 and 6,550 nucleotides, respectively. The novel strain showed a similar genome organization like other PUUV strains with an identity of 80.1% to 84.7% at the level of the nucleotide sequence, and between 89.5% and 98.1% for the deduced amino acid sequences. A sliding-window analysis of PUUV strain sequences revealed different level of sequence variability along the whole genome. The highest sequence variability was found at the 3´NCR of N protein and GPC, whereas regions between residues 876 and 1258 in RdRp showed high sequence conservation. The identification of regions with different levels of sequence variability will allow a future rational design of RT-PCR assays to study the molecular evolution of PUUV at different scales, i.e. within the host, in the same populations and in different populations. The investigations of PUUV in bank voles from Germany and north-eastern Poland confirmed the presence of PUUV in almost all parts of Europe, but with very different prevalences and a non-homogenous distribution. The initial study in Poland indicated the presence of PUUV infections in bank voles from the Eastern and Carpathian lineage. In contrast to results from different endemic parts of Germany the prevalence of PUUV infections in the bank voles from north-eastern Poland was rather low. An initial study of the PUUV sequence variation within the same animal was performed for bank voles from north-eastern Poland and the district Osnabrück. Nucleotide sequence determination of cloned S and M segment derived PUUV sequences suggest the presence of a quasispecies, although the frequency of nucleotide substitutions was found to be low. Future investigations will have to combine the ongoing bank vole field study approach with in vitro and animal model studies on the susceptibility of the different bank vole lineages for PUUV infection. In addition, the long-term study in the district of Osnabrück should be used for analysis of the spatial and temporal microevolution of PUUV and to prove the presence and variation of the PUUV quasispecies within persistently infected voles. These studies will profit from the future application of Next Generation Sequencing approaches.

Hantaviren wurden ursprünglich für ausschließlich Nagetier-assoziierte Pathogene gehalten. Jedoch wurden in den vergangenen Jahren viele neue Hantaviren in Spitzmäusen, Maulwürfen und Fledermäusen entdeckt. Das Genom der Hantaviren besteht aus drei Genomsegmenten small (S), medium (M) and large (L). Gegenwärtig sind nur Nagetier-übertragene Hantaviren als humanpathogen bekannt. Das Puumala virus (PUUV) verursacht eine milden bis moderaten Verlauf des Hämorhagischen Fiebers mit renalem Syndrom in Europa, mit durchschnittlich 10.000 humanen Fällen jährlich. Der Reservoirwirt des PUUV ist die Rötelmaus (Clethrionomys glareolus), eine Wühlmaus, die in fast ganz Europa vorkommt. Das Ziel der Untersuchungen bestand in der Entwicklung von Methoden für eine parallele Analyse der Phylogeographie des PUUV und der Rötelmaus in Mitteleuropa, und insbesondere Deutschland, in großem und kleinem geografischen Maßstab. Deshalb wurden neue Methoden sowohl für die molekulare Identifikation von Nagetierarten und die Unterscheidung von Rötelmauslinien als auch die molekulare Differenzierung von PUUV-Stämmen etabliert. Hierfür wurde zunächst ein neuer molekularer Test auf der Basis Cytochrom b (cyt b)-spezifischer degenerierter Primer zur molekularen Identifikation von Kleinsäugern etabliert. Dieser Assay wurde für Kleinsäuger aus Deutschland validiert, die den Ordnungen Rodentia, Soricomorpha, Erinaceomorpha, Lagomorpha, Carnivora und Chiroptera angehören. Anschließend wurde die Methode erfolgreich für Kleinsäugerproben aus anderen Teilen Europas, Asiens und Afrikas angewendet. Daneben wurde der neue Test zur Differenzierung von genetischen Linien der Rötelmaus in Mitteleuropa angewendet. Rötelmäuse aus Nordost-Polen wurden der Karpatischen und der Östlichen Linie zugeordnet. Die Untersuchung von Rötelmäusen aus Deutschland zeigte das Vorkommen von drei genetischen Linien, der Westlichen, Östlichen und Karpatischen Line, mit einer unterschiedlichen, aber partiell überlappenden Verbreitung in Deutschland. Für dasVerständnis der Rekolonierungsrouten der Rötelmauslinien und der mit ihnen assoziierten Krankheitserreger sind zukünftige detailliertere Untersuchungen der verschiedenen Rötelmauslinien erforderlich. Die erste komplette Genomsequenz eines PUUV-Stammes aus Mitteleuropa wurde durch eine Kombination von Primer-Walking und RNA-Ligation bestimmt. Die Länge der S-, M- und L-Segmente des PUUV-Stammes au seiner Rötelmaus aus Astrup, Niedersachsen, betragen – 1828, 3680 bzw. 6550 Nukleotide. Der neue Stamm zeigte eine zu allen anderen PUUV-Stämmen ähnliche Genomorganisation mit einer Identität von 80,1% bis 84,7% auf Nukleotidsequenzebene und zwischen 89,5% und 98,1% auf der Aminosäuresequenzebene. Eine sliding-window-Analyse von PUUV-Sequenzen zeigte entlang der drei Genomsegmente Regionen mit unterschiedlicher Variabilität. Die höchste Sequenzvariabilität wurde in der 3´-NCR gefunden, während die RdRp-Region zwischen den Aminosäuren 876 und 1258 hochkonserviert ist. Die Identifikation von Regionen mit unterschiedlichem Niveau der Sequenzvariabilität wird zukünftig ein rationales Design von RT-PCR-Assays für die Untersuchung der molekularen Evolution des PUUV auf unterschiedlichen Stufen, im Reservoirwirt, in der gleichen Population oder zwischen Populationen, erlauben. PUUV-Untersuchungen in Rötelmäusen aus Deutschland und Nordostpolen bestätigte das breite geografische Vorkommen des Virus in fast ganz Europa, aber mit sehr verschiedenen Prävalenzen und einer inhomogenen Verbreitung. Die Pilotstudie in Polen zeigte das Vorkommen von PUUV-Infektionen in Rötelmäusen der Östlichen und Karpatischen Linie. Im Gegensatz zu Ergebnissen in verschiedenen Endemiegebieten in Deutschland war die Prävalenz der PUUV-Infektionen in Rötelmäusen aus Nordostpolen relativ gering. Eine initiale Studie der PUUV-Sequenzvariation in einzelnen Tieren wurde für ausgewählte Rötelmäuse aus Nordostpolen und aus dem Landkreis Osnabrück durchgeführt. Die Nukleotidsequenzbestimmung von klonierten PUUV-S- und -M-Segment-Sequenzen deutet auf das Vorkommen von Quasispezies hin, obgleich die Häufigkeit von Nukleotidsubstitutionen gering war. Zukünftige Untersuchungen sollten Feldstudien an Rötelmäusen mit in vitro- und Tiermodell-Studien kombiniert werden, um die Suszeptibilität der verschiedenen Rötelmauslinien für eine PUUV-Infektion zu überprüfen. Außerdem sollte eine Longitudinalstudie im Landkreis Osnabrück für die Analyse der räumlichen und zeitlichen Mikroevolution des PUUV und das Vorkommen und die Variation einer PUUV-Quasispecies in persistent infizierten Rötelmäusen genutzt werden. Diese Studien werden von einer zukünftigen Anwendung der Next Generation Sequencing-Technologie profitieren.