Molecular analysis of a multi-resistant bovine Pasteurella multocida strain from the U.S.A

In der vorliegenden Dissertation wurde ein multi-resistenter Pasteurella multocida-Stamm von einem an einer Atemwegsinfektion erkrankten Rind aus den U.S.A. hinsichtlich seiner Genomstruktur und den genetischen Grundlagen der Multi-Resistenz untersucht. Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeiten war die Identifizierung neuer Gene für Resistenz gegenüber Makroliden und Triamiliden. Vertreter dieser beiden Wirkstoffklassen werden häufig bei Atemwegsinfektionen von Rindern eingesetzt und die Grundlagen der Resistenz gegenüber Makroliden und Triamiliden bei entsprechenden Erregern waren weitgehend unbekannt. Für diese Dissertation wurde der repräsentative P. multocida-Stamm 36950 ausgewählt. Da PCR-basierte Suchen nach bekannten erm-Genen sowie Transformationsexperiemnte keine Erfolge zeigten, wurde P. multocida 36950 einer Gesamtgenomsequenzierung unterzogen. Die Untersuchung der dabei erhaltenen Contigs führte zur Identifizierung des neuen rRNA-Methylase-Gens erm(42), des Makrolid-Transportergens msr(E) und des Makrolid-Phosphotransferasegens mph(E). Funktionelle Klonierung und Expression dieser Gene in einem makrolidempfindlichen P. multocida-Empfängerstamm bestätigten, dass erm(42) in erster Linie Resistenz gegenüber Tilmicosin und Linkosamiden wie Clindamycin vermittelte, aber die minimale Hemmkonzentration (MHK) für Tulathormycin nur leicht erhöhte. Im Gegensatz dazu vermittelten die Gene msr(E)-mph(E) Resistenz gegenüber Tilmicosin und Tulathromycin, hatten aber keinen Effekt auf die MHK-Werte für Linkosamide. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen klärten erstmalig die genetischen Grundlagen der Resistenz gegenüber Makroliden, Triamiliden und Linkosamiden bei P. multocida [Chapter 2]. Weitere Untersuchungen der Genomsequenz von P. multocida 36950 sowie Vergleiche mit anderen Genomen zeigten, dass die drei vorab identifizierten Resistenzgene Bestandteil eines mobilen genetischen Elements, des integrativen und konjugativen Elements ICEPmu1, waren. ICEPmu1 ist das erste bei P. multocida jemals beschriebene ICE [Chapter 3]. Zusätzlich zu den drei Makrolid/Triamilid-Resistenzgenen trägt ICEPmu1 noch weitere neun Resistenzgene. Elf der insgesamt 12 Resistenzgene vermitteln Resistenz gegenüber Streptomycin (strA und strB), Streptomycin/Spectinomycin (aadA25), Gentamicin (aadB), Kanamycin/Neomycin (aphA1), Tetrazyklin [tetR-tet(H)], Chloramphenicol/Florfenicol (floR), Sulphonamiden (sul2), Tilmicosin/Clindamycin [erm(42)] oder Tilmicosin/Tulathromycin [msr(E)-mph(E)]. Zusätzlich wurde ein komplettes β-Laktamasegen, blaOXA-2, nachgewiesen, welches aber bei P. multocida funktionell inaktiv zu sein scheint. Alle diese Resistenzgene waren in zwei Regionen von etwa 15.7 und 9.8 kb Größe organisiert. Resistenz gegenüber dem Chinolon Nalidixinsäure und dem Fluorchinolon Enrofloxacin basierte auf Punktmutationen in der Chinlonresistenz-vermittelten Region der Gene gyrA und parC [Chapter 3]. Solch ein umfassender Multi-Resistenzphänotyp wurde bislang selten bei P. multocida und anderen bovinen Atemwegsinfektionserregern beobachtet. Die nachgewiesenen Resistenzgene und resistenzvermittelnden Mutationen erklären vollständig den nachgewiesenen Multi-Resistenzphänotyp [Chapter 3]. Das 82.214 bp große ICEPmu1 besitzt insgesamt 88 Gene. Die Gene von ICEPmu1, deren Genprodukte in Prozesse wie Exzision/Integration und konjugativer Transfer beteiligt sind, ähneln denen, die bei einem 66.641 bp großen ICE von Histophilus somni gefunden wurden. ICEPmu1 integriert in eine tRNALeu und wird von 13 bp großen direkten Sequenzwiederholungen flankiert. ICEPmu1 überträgt sich durch Konjugation in andere Bakterien wie P. multocida, M. haemolytica und E. coli, wo es auch eine tRNALeu zur Integration nutzt und eng verwandte 13 bp große direkte Sequenzwiederholungen an der Integrationsstelle produziert. ICEPmu1 und seine zirkuläre Zwischenform wurden in den Transkonjuganden mittels PCR- und Sequenzanalysen bestätigt. PCR-Analysen und Empfindlichkeitsprüfungen zeigten dass die ICEPmu1-assoziierten Resistenzgene in den Transkonjuganden funktionell aktiv waren. Lediglich das Gen blaOXA-2 war in den P. multocida- und M. haemolytica-Transkonjuganden inaktiv, in dem E. coli-Transkonjugand jedoch aktiv [Chapter 4]. Die neuen Makrolid/Triamilid-Resistenzgene wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, auch Resistenz gegenüber Gamithromycin und Tildipirosin, zwei neuen Makroliden, die im Laufe dieses Dissertationsprojektes zugelassen wurden, zu vermitteln. Basierend auf den beobachteten Steigerungen der MHK-Werte für P. multocida B130-Klone, die die klonierten Gene erm(42) oder msr(E)-mph(E) trugen, vermittelt erm(42) in erster Linie Resistenz gegenüber Tildipirosin MIC (128-facher Anstieg des MHK-Werts) während in Gegenwart von msr(E)-mph(E) ein 256-facher Anstieg des MHK-Werts für Gamithromycin bei P. multocida B130 zu verzeichnen war. Diese Beobachtungen wurden durch die Untersuchung von P. multocida- und M. haemolytica-Feldisolate bestätigt, die die drei Resistenzgene in unterschiedlichen Kombinationen enthielten [CHAPTER 5]. ICEPmu1 ist in der Lage, sich über Stamm-, Spezies- und Genusgrenzen auszubreiten. Da es über 12 Resistenzgene verfügt, die zum Teil auch Resistenz gegenüber den neusten, für die Behandlung boviner Atemwegsinfektionen zugelassenen Wirkstoffen vermitteln, reduziert die Ausbreitung dieses ICEs drastisch die therapeutischen Optionen. Die Verbreitung von ICEPmu1 bei bovinen Atemwegsinfektionserregern wird als besondere Bedrohung in Bezug auf antimikrobielle Resistenz bei Infektionserregern Lebensmittel liefernder Tiere angesehen [Chapter 6].