Development of novel diagnostic assays for the detection and surveillance of Rift Valley fever virus infections in ruminants and camels

Das Rifttal-Fieber-Virus (RVFV) gehört zur Familie der Bunyaviridae und ist ein vektorübertragenes zoonotisches RNA-Virus, das schwere, zum Teil tödliche hämorrhagische Fieber, Retinitis sowie Meningoenzephalitiden bei einem Prozent der humanen klinischen Fälle auslöst. Bei landwirtschaftlichen Nutztieren, insbesondere bei kleinen Wiederkäuern und Rindern sowie bei Kamelen, führt eine Infektion mit RVFV zu Fieber in Verbindung mit einer hohen neonatalen Morbidität und Mortalität. Ein charakteristisches Zeichen für eine Infektion mit dem RVFV ist ein massenhaftes Verlammen bei trächtigen Schafen und Ziegen, das als „abortion storm“ bezeichnet wird. Menschen können sich durch direkten Kontakt mit infektiösen Körperflüssigkeiten oder Gewebe von infizierten Nutz- oder Wildtieren infizieren. Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist das Virus in Afrika und auf der Arabischen Halbinsel aufgetreten. Mehr als 30 Stechmückenarten, die auch in gemäßigten Klimazonen vorkommen, sind mögliche kompetente Vektoren für das Virus, sodass die ständige Gefahr einer Viruseinschleppung und -ausbreitung in nicht-endemische und/oder bislang nicht betroffene Länder besteht. Sowohl in Endemiegebieten mit regelmäßigen epizootischen Ausbrüchen als auch in bislang Rifttal-Fieber-freien Ländern müssen schnelle und gut funktionierende serologische und molekulare Nachweismethoden verfügbar sein, um zielgerichtete und schnelle Bekämpfungsmaßnahmen in aktuellen und zukünftigen Ausbrüchen durchführen zu können. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue diagnostische Nachweismethoden zu etablieren und zu validieren. Die Methoden konnten erfolgreich in einem aktuellen Ausbruchsgeschehen eingesetzt werden. Dabei wurden Serumproben von infizierten Tieren sowohl umfassend serologisch untersucht als auch RVFV-Isolate molekular charakterisiert. RVFV-Strukturproteine (Nukleokapsidprotein NP sowie die Glykoproteine Gn und Gc) wurden bakteriell exprimiert, aufgereinigt und als Immunogene für die Herstellung von poly- und monoklonalen Antikörpern sowie als Antigen für serologische Testverfahren verwendet. Alle drei Proteine waren hoch-immunogen in Kaninchen und Mäusen, was die Generierung von poly- und monoklonalen Antikörpern ermöglichte. Insgesamt 45 ELISA-reaktive murine monoklonale Antikörper wurden mit Hilfe des Western Blots sowie eines adaptierten indirekten Immunfluoreszenztests weiter charakterisiert. 32 der Klone detektierten konformationelle Epitope der Virusproteine, was auch einen Einsatz der Antikörper für immunhistochemische Untersuchungen zur Antigendetektion ermöglicht. Ein gegen das Gn-Protein gerichteter monoklonaler Antikörper zeigte außerdem vielversprechende Ergebnisse in einem kompetitiven ELISA sowohl mit einem polyklonalen Kaninchenserum als auch mit Serumproben von RVFV-infizierten Schafen und Ziegen. Da schon vier bis acht Tage nach einer Infektion mit dem Rifttal-Fieber-Virus Antikörper gegen beide Glykoproteine detektiert werden können, wurde ein neuer indirekter ELISA basierend auf Glykoprotein Gn entwickelt, welcher eine Alternative zu bisher publizierten und/oder kommerziell erhältlichen ELISAs darstellt, die das Nukleokapsidprotein als Antigen verwenden. Der direkte Nachweis von Gn- als auch NP-spezifischen Antikörpern ermöglicht somit auch den Einsatz von DIVA-Impfstoffen (Differentiating Infected from Vaccinated Animals), die sich aus Untereinheiten des RVFV zusammensetzen. Die Validierung des neuen Gn-ELISAs erfolgte mit fast 2000 Feldproben aus vier afrikanischen Ländern (Senegal, Mosambik, Uganda und Jemen). Alle Serumproben waren bereits vorher mit dem Virusneutralisationstest (VNT) getestet worden, der als Goldstandardmethode angesehen wird. Aufgrund der erreichten Sensitivität von 94,56% und einer Spezifität von 95,57% kann der Gn-ELISA als diagnostische Nachweismethode in Monitoring Untersuchungen eingesetzt werden. Die hohe Korrelation zwischen den Ergebnissen des Gn-ELISAs und des Virusneutralisationstests zeigt, dass neutralisierende Antikörper vor allem gegen das Gn-Protein gerichtet sind. Der neue Gn-ELISA wurde schließlich für die Untersuchung von 163 Serumproben verwendet, die von Dezember 2010 bis Februar 2011 während der späten Phase eines RVFV Ausbruchs in Mauretanien von kleinen Wiederkäuern, Rindern und Kamelen gesammelt worden waren. Die Gesamtseroprävalenz bei diesen Tieren lag bei 57%. Hohe Übereinstimmung des Gn-ELISAs wurde in parallelen Untersuchungen mit adaptierten indirekten Immunfluoreszenztests und kommerziellen NP-basierten ELISAs erzielt. Der hohe Anteil von IgM-Antikörpern mit einer Prävalenz von fast 53% bei Schafen und Ziegen weist auf ein kontinuierliches Ausbruchs- und Verbreitungsgeschehen hin und bietet eine Erklärung für den erneuten RVF-Ausbruch im Jahr 2012. Weiterhin konnte in vier der getesteten Kamelseren virale RNA mittels real-time PCR nachgewiesen werden, was die wichtige Rolle von Kamelen bei der Verbreitung und Vermehrung des Virus unterstreicht. Da Kamele in Mauretanien in engem Kontakt zum Menschen leben und auch ein wichtiges grenzüberschreitendes Transportmittel sind, stellen sie ein erhebliches Risiko für eine Virusübertragung dar. Die hier beschriebenen neu entwickelten Nachweismethoden stellen wichtige Ergänzungen zu den bereits existierenden Methoden dar, was im Rahmen einer RVF Epidemie in Mauretanien gezeigt werden konnte. Aufgrund der Robustheit der entwickelten Testsysteme, mit denen außerdem auch schnelle und zuverlässige Ergebnisse zur Verfügung stehen, sind sie sowohl zur Anwendung in endemischen Regionen Afrikas als auch in bisher noch nicht betroffenen Ländern, zum Beispiel in Europa oder Nordamerika, geeignet.