Untersuchungen zur MHC Klasse I-vermittelten Präsentation chlamydialer Peptidantigene in Dendritischen Zellen

Kägebein, Danny GND

Bei der Bekämpfung chlamydialer Infektionen spielen CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle. Für diese ist die Aktivierung durch MHCI-präsentierte Peptidantigene auf der Oberfläche Chlamydien-infizierter DCs von entscheidender Bedeutung. Die intrazellulären Mechanismen, die zu einer effektiven MHCI-Präsentation führen sind jedoch weitestgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenprozessierung und -präsentation chlamydialer Peptidantigene anhand von in vitro-Infektionsstudien und funktionaler Antigenpräsentations-Assays untersucht. Dafür wurde die immortalisierte murine DC-Zelllinie JAWSII und CD8+ T-Zellen aus der Milz Chlamydien-infizierter C57BL/6-Mäuse verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Chlamydien nach der PDI-abhängigen Aufnahme durch Clathrin- beziehungsweise Caveolin-vermittelte Endozytose eine PV ausbilden, die durch ein Gerüst aus Vimentin stabilisiert wird. Durch die Infektion kommt es zur Reifung der DCs einhergehend mit einer erhöhten Oberflächenexpression von MHCI-Molekülen. Für die Neusynthese dieser ist die TLR-2-abhängige Aktivierung des NF-kB-Signalweges verantwortlich. Für die erhöhte Oberflächenexpression scheint jedoch der p38- und ERK1/2- abhängige Transport vorgefertigter MHCI-Moleküle vom GA zur Plasmamembran der zeitbestimmende Schritt zu sein. Neben dem Oberflächentransport sind p38 und ERK1/2 auch entscheidend für die Aktivierung der cPLA2. Diese produziert nach Hspb-1- vermittelter Translokation an das Vimentin-Gerüst der PV, Arachidonsäure, die sich in die Membran der PV einlagert und somit zur Destabilisierung derselben führt. Dadurch gelangen akkumulierte CPAF-Moleküle ins Zytosol der DCs, wo sie beginnen das Vimentin- Gerüst abzubauen. Dies wiederum führt zur Freisetzung der Chlamydien ins Zytosol. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Bildgebungsverfahren konnte gezeigt werden, dass die freigesetzten zytosolischen Chlamydien zunächst ubiquitiniert und durch den Adaptorkomplex p62/SQSTM-1 erkannt werden. Dieser führt die Chlamydien anschließend LC-3- positiven Autophagosomen zu, in denen die chlamydialen Antigene durch Cathepsine prozessiert werden. Dabei werden ausschließlich chlamydiale Proteine prozessiert, die im bakteriellen Zytoplasma oder der Membran lokalisiert sind. Die prozessierten Peptidantigene werden im Zytosol weiterprozessiert und gelangen entweder über den klassischen MHCI-Präsentationsweg oder den vakuolaren Kreuzpräsentations-Weg auf die Zelloberfläche. Da Epithelzellen die primären Zielzellen einer Chlamydien-Infektion sind, ist die Erkennung und Eliminierung dieser durch CD8+ T-Zellen essentiell für die anti-chlamydiale Immunantwort. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass Chlamydien-infizierte Epithelzellen in der Lage sind Peptidantigene auf MHCI-Molekülen zu präsentieren und dass die postulierte CPAF-vermittelte Reduzierung der MHCI-Oberflächenexpression nicht stattfindet. Zudem konnte gezeigt werden, dass IFN-gamma-stimulierte Epithelzellen einen DC-Infektionsphänotyp, charakterisiert durch erhöhte cPLA2-Aktivität und Lokalisation der Chlamydien in Autophagosomen, zeigen. Dies deutet daraufhin, dass Epithelzellen, die durch IFN-gamma von aktivierten Effektor-T-Zellen stimuliert wurden, in der Lage sind, chlamydiale Antigene autophagosomal zu prozessieren und zu präsentieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben erstmals ein erweitertes Verständnis der MHCI- vermittelten Antigenpräsentation in Chlamydien-infizierten DCs und liefern entscheidende Hinweise für zukünftige immunologische Therapieansätze und Impfstrategien.

CD8+ T-cells play an essential role for chlamydial infections. For the activation of these T cells presentation of surface MHCI-peptide complexes by chlamydia-infected dendritic cells is pivotal. Thus intracellular mechanism leading to an effective antigen-presentation are so far elusive. In this study the antigen-presentation was analyzed by in vitro infection studies and functional antigen-presentation assays. Therefore immortalized dendritic cell line JAWSII and CD8+ T-cells from C57BL/6 mice were used. It was shown that chlamydia are taken up by clathrin- or caveolin-mediated endocytosis depending on the protein-disulfide isomerase PDI. After internalization chlamydia build up a parasitophorous vacuole (PV) surrounded by a vimentin cage-like structure. Chlamydial infection leads to maturation of DCs characterized by increased surface MHCI presentation depending on NF-kB, p38 and ERK1/2 activation. p38 and ERK1/2 are also important for activation of cPLA2. This enzyme produces arachidonic acid (AA) after HspB-1-mediated translocation to the PV leading to destabilization of the PV membran accompanied by the release of chlamydia into cytosol of DCs. By different microscopic techniques it was shown that cytosolic chlamydia are ubiquitinated and recognized by p62 adaptor complex. This complex recruits ubiquitinated chlamydia into LC-3-positive isolation membranes thus forming an autophagosome. Here chlamydial antigens are processed by endosomal cathepsins. Mainly chlamydial proteins lo cated in the bacterial cytoplasma or the bacterial membrane are processed by DCs and then loaded onto MHCI complexes. The peptide-MHCI complexes are translocated to the cell surface via classical or non-classical MHCI presentation pathways the latter also called cross-presentation. Epithelial cells as primary target cells of chlamydial infection are also able to present chlamydial antigens on the cell surface in context with MHCI molecules. This result refutes the proposed CPAF-mediated immune evasion mechanism. Furthermore it was shown that IFN-gamma stimulated epithelial cells show a DC-like infection phenotype characterized by increased cPLA2 activation and localization of chlamydia in autophagosomes. This indicates that IFN-gamma of activated effector T-cell induces autophagosomal processing of chlamydial antigens also in epithelial cells. The results of this work allow for the first time an extensive understanding of chlamydial antigen processing by DCs thereby giving new directions for novel therapy strategies.

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Kägebein, Danny: Untersuchungen zur MHC Klasse I-vermittelten Präsentation chlamydialer Peptidantigene in Dendritischen Zellen. Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät, Institut für Mathematik und Informatik, Institut für Immunologie und Transfusionsmedizin 2015.

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