Expression studies of peste des petits ruminants virus (PPRV) haemagglutinin and fusion envelope glycoproteins

Pest der kleinen Wiederkäuer (PPR) ist eine hoch infektiöse und sich gegenwärtig stark ausbreitende virale Erkrankung der kleinen Haus- und Wildwiederkäuer. Es ist eine der meldepflichtigen Krankheiten des Internationalen Tierseuchenamts (OIE). Aufgrund seiner sehr hohen Morbidität und Mortalität hat diese Tierseuche dramatische wirtschaftliche Auswirkungen auf die landwirtschaftliche Haltung kleiner Wiederkäuer in Entwicklungsländern, in denen sie endemisch ist. PPR wird verursacht durch das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (PPRV), einem Mitglied der Gattung Morbillivirus in der Unterfamilie Paramyxovirinae der Familie Paramyxoviridae in der Ordnung Mononegavirales. PPRV hat zwei Oberflächenglykoproteine: das Hämagglutinin (H) und das Fusionsprotein (F), die in der viralen Hülle als Spikes erscheinen. Diese Oberflächenglykoproteine führen durch Anheftung über H und anschließender F-vermittelter Fusion der viralen Hülle mit der Wirtszellmembran zum Eindringen des Virus in die Zielzelle. PPRV-F vermittelnde Zell-Zell Fusion führt zur Bildung von Synzytien, ein Merkmal bei PPRV infizierten Zellkulturen, das es dem Virus ermöglicht sich direkt von Zelle zu Zelle auszubreiten. Somit sind H und F die wichtigsten Angriffspunkte für eine schützende Immunantwort in infizierten und geimpften Tieren durch neutralisierende Antikörper. Aufgrund ihrer Lage und Funktion sind H und F gute Kandidaten für die Entwicklung neuartiger diagnostischer Tests auf Basis rekombinanter Biotechnologie. Die Sequenzierung der gesamten offenen Leserahmen (ORFs) von H und F des Impfstammes PPRV Nigeria 75/1 (Linie I) und des virulenten Feldisolates PPRV Kurdistan Stamm 2011 (Linie IV) ergab Längen von 1827 beziehungsweise 1638 Nukleotiden (nt) (ohne die jeweiligen Stopcodons), die folglich für Proteine von 609 und 546 Aminosäuren (aa) mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von 68 kDa und 60 kDa kodieren. Die Nukleotidsequenzen H- und F-ORFs des PPRV-Stammes Kurdistan 2011 wurden in die GenBank eingestellt (Zugriffsnummern KF648288.1 beziehungsweise KF648287.1). Vergleichende Aminosäuren- (aa) und Nukleotidsequenzanalysen (nt), durchgeführt mit den jeweiligen vollständigen Sequenzen mit den entsprechenden Sequenzen in Genbank ergab den höchsten Gad an Homologie mit PPRV Linie IV Stämme, vertreten durch die PPRV Turkey 2000. Phylogenetische Neighbor-joining Tree Analysen, erzeugt entweder auf der Basis der vollen Länge (1827 nt) oder teilweiser 612 nt (1174-1785 nt) Nukleotidsequenzen des H-ORF beziehungsweise der vollen Länge (1638 nt) oder der teilweise 322 nt (254-575 nt) Nukleotidsequenzen des F-ORF, ordneten Kurdistan 2011 dem Linie IV Genotyp zu. Die zur Verfügung stehenden monoklonalen Antikörper (MAK) gegen F und H waren nicht geeignet, Expression und Reifung der genannten Proteine zu untersuchen, da diese weder im Immunoblots noch in der Immunpräzipitation einsetzbar waren. Daher wurden Segmente der ORFs, ausgewählt auf Grund der Hydrophobizitätsprofile ihrer kodierten Aminosäuresequenz, in-frame an den ORF für das Maltose-Bindungsprotein im Plasmid pMal-p2X fusioniert und in E.coli TB1 exprimiert. Monospezifische Seren gegen gereinigte Fusionsproteine wurden in Kaninchen hergestellt. Die jeweiligen Seren erkannten spezifisch die zugehörigen Zielproteine in indirekten Immunfluoreszenz, Immunoblots und Immunpräzipitation-Assays. In VeroMontpellier-Zellen entstanden nach Infektion mit dem PPRV Nigeria 75/1 Impfstamm keine Synzytien. Die Analysen der Expression und der intrazellulären Reifung mit Hilfe der monospezifischen Antikörper ergaben, daß H wie erwartet exprimiert und modifiziert wurde. Im Gegensatz dazu schien die Reifung von F sehr ineffizient zu erfolgen was das Fehlen der Synzytien Bildung in infizierten VeroMontpellier Zellen erklären kann. Diese Eigenschaft könnte jedoch von Vorteil für die Virusausbeute sein da die erreichten Titer in infizierten VeroMontpellier Kulturen ca 100-fach höher sind als in Synzytien bildenden Vero/dog-SLAM Zellen. Für die ektopische Expression von H und F wurden verschiedene Ansätze versucht, welche die Integration der gesamten oder partieller offener Leserahmen (ORFs) für H und F von PPRV Nigeria 75/1 in verschieden Vektoren umfassten. Alle Versuche die PPRV-Oberflächenglykoproteine durch das bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) mittels einer eigenen Expressionskassette als Ganzes oder in Teilen genetisch fusioniert an die aminoterminale Untereinheit des essentielle Glycoprotein B (gB), waren erfolglos. Transiente Expressions und Komplementationsanalysen zur Klärung der Ursache(n) der Inkompatibilität der PPRV Proteinexpression mit infektiöser BHV-1 Replikation ließen darauf Schließen, daß F und H mit dem intrazellulären Transport von gB interferieren und dadurch die Entstehung von BHV-1 Rekombinanten unmöglich. Da sich die zur Überexpression von Proteinen häufig verwendeten immediate early Enhancer/Promotor Elemente des murinen und humanen Cytomegalovirus als nicht geeignet für eine deutliche Expression von PPRV F und H erwiesen hatten, wurde, das Expressionsplasmid pCAGGS auf Tauglichkeit geprüft. In diesem Plasmid kontrolliert ein Hybrid Enhancer/Promotor Element (Enhancer vom humanes Cytomegalovirus, Promotor vom Hühner ß-Aktin Gen) die Transkription des Ziel-ORF. Die jeweiligen ORFs der Membranglycoproteine der Stämme Nigeria 75/1 Impfstamm und Kurdistan 2011 wurden in pCAGGS integriert und deren Expression nach transienter Expression mit Hilfe der monospezifischen Seren analysiert. Die Ergebnisse zeigten, daß die jeweiligen Proteine in signifikanten Mengen synthetisiert und in die Zellmembranen eingelagert werden. Damit wurde die Voraussetzung geschaffen, in zukünftigen Arbeiten neuartige, auf der ektopischen Expression von PPRV F und H basierende, Diagnostika zu entwickeln.