Untersuchungen zur Eignung von ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen Mycobacterium avium spp. paratuberculosis in Tankmilchproben aus Rheinland-Pfalz
Die Paratuberkulose,eine durch Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) verursachte, in Deutschland meldepflichtige Tierkrankheit, führt zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten in Milch-produzierenden Rinderbetrieben. Über den tatsächlichen Durchseuchungsgrad deutscher Rinderbestände mit MAP gibt es keine gesicherten Erkenntnisse. Ein bundesweites Monitoring zur Abschätzung der Herdenprävalenz in Milchviehherden wäre auf der Basis von Tankmilchproben finanziell vertretbar.Zunächst wurden deshalb zwei ELISAs (SVANOVIR Ptb-ELISA, DEXX-M.pt.Milk test kit) zum Nachweis von Antikörpern gegen MAP für Tank-milchproben validiert, wobei der Paratuberkulose-Status der Bestände auf der Basis der Betriebshistorie als „Goldstandard“ zugrunde gelegt wurde. Bei Anwendung der Bewertungskriterien der Hersteller ergaben sich folgende Ergebnisse: „Paratuberkulose-negativen“ Betriebe wurden durch beide Tests als negativ bewertet,„Paratuberkulose-positive“ bzw.„Paratuberkulose-serologisch-positive“ Betriebe wurden im Tankmilch-Test jedoch nur in einem Fall (Svanovir) bzw. in drei Fällen (IDEXX) als positiv erkannt. Bezog man die fraglichen Testergebnisse als positiv ein, so blieben 82,9 % (Svanovir) bzw. 80 % (IDEXX) der „Paratuberkulose-positiven“ und „Paratuberkulose-serologisch-positiven“ Betriebe unerkannt. Dennoch wurde versucht, die beiden ELISAs für Tankmilchproben mittels ROC-und TG-ROC-Analysen neu zu validieren und dabei für Tankmilchproben optimierte Grenzwerte (cut-offs) zu finden. Wurde eine hohe Spezifität zu Grunde gelegt, ließ sich keine akzeptable Sensitivität mehr erzielen. Dabei wurden die günstigsten Ergebnisse bei einer Sensitivität von lediglich 32,3 % und einer Spezifität von 100 % (Svanovir) erzielt. Mit nur einer geringfügigen Verschiebung des cut-off ließ sich die Sensitivität zwar auf einen ebenfalls nicht akzeptablen Wert von 57 % erhöhen, die Spezifität sank dabei aber auf 67 %. Ähnliche Ergebnisse wurden mit dem IDEXX-ELISA erzielt. Danach wurde versucht,den Svanovir-ELISA für Tankmilchproben auf der Basis der aktuellen Paratuberkulose-Innerherdenprävalenz zu validieren, wobei Einzelmilchproben aus 69 der rheinland-pfälzischen Betriebe herangezogen wurden. Zunächst wurden die Tankmilchproben in zwei Laboratorien untersucht und die Ergebnisse verglichen. Dabei ergaben sich erhebliche Unterschiede in der Bewertung derselben Proben. Für nahezu alle Proben wurde in einem Labor ein höherer Ergebniswert errechnet, als er für dieselben Proben in dem anderen Labor ermittelt worden war. Die Unterschiede führten in vielen Fällen zur Einstufung in verschiedene Prävalenzklassen. In den Herden wurden Prävalenzen zwischen 0 und 37 % geschätzt. Dabei ergab sich nur eine schwache Übereinstimmung zwischen historischem Paratuberkulose-Status der Betriebe und den milchserologischen Innerherdenprävalenzschätzungen. Diese spiegelt sich in einem geringen Kappa-Index von 0,146 wider. Für die Ermittlung von Sensitivität und Spezifität des ELISA für Tankmilchproben mittels ROC- bzw.TG-ROC-Analysen wurden 116 Tankmilchproben herangezogen,die den Betrieben eindeutig zuzuordnen waren. Das optimalste Verhältnis von Sensitivität (81 %) und Spezifität (77 %) wurde erreicht, wenn der cut-off bei einem prozentualen Probenwert von 10 % festgelegt wurde. Diese ermittelten Werte für Sensitivität und Spezifität lagen deutlich über den Werten, die bei der Evaluierung desselben ELISA mit dem historischen Para-tuberkulose-Status der Betriebe als „Goldstandard“ ermittelt worden waren. Die Ergebnisse dieser Studie stellen die Brauchbarkeit der verfügbaren Testsysteme für die Untersuchung von Tankmilchproben in Frage. Bezieht man außerdem in die Schlussfolgerungen ein,dass für den Svanovir-ELISA bei Einzelmilchproben nur eine Sensitivität von ca. 60 % im Vergleich zu den blutserologischen Einzeltieruntersuchungen diskutiert wird und die blutserologischen Untersuchungen resultierend aus der Spezifik der Pathogenese dieser Erkrankung ebenfalls nur eine begrenzte Sensitivität bei Einzeltieruntersuchungen aufweisen, scheinen die von uns geprüften Testsysteme für die Herdendiagnostik aus Tankmilchproben zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht geeignet zu sein.
Paratuberculosis or Johne’s Disease,caused by Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), is a notifiable disease in Germany which produces enor-mous economical losses in dairy farms. At present, there is no confirmed data about the actual number of infected livestock herds in Germany. A countrywide monitoring program to evaluate the prevalence in dairy herds would only be economically feasible on the basis of bulk milk testing. In this study we evaluated two ELISA test kits (SVANOVIR Ptb-ELISA, IDEXX-M.pt. Milk test kit) for the detec-tion of antibodies against MAP in bulk milk. First, the Paratuberculosis-status of the herd derived from the history of the farm was used as a gold Standard. Paratuberculosis-negative farms were tested negative with each test, but paratuberculosis-positive or Paratuberculosis-serologically-positive farms were detected only in one case (Svanovir) or three cases (IDEXX), respectively. Even if inconclusive results are counted as positive, 82.9 % (Svanovir) or 80 % (IDEXX) of the paratuberculosis-positive or serologically paratuberculosis positive farms were not detected. Nevertheless,a re-validation of both ELISAs by means of ROC and TG-ROC analyses was attempted by searching for ideal cut-offs, optimised for bulk milk. If a high specificity was selected, no acceptable sensi-tivity could be reached.The best results were obtained using a sensitivity of 32.3 % at a specificity of 100 % (Svanovir). With a small change of the cut-off value,the sensitivity increased to still 57 %, but this reduced the specificity to 67 %. Similar results were obtained with the IDEXX-ELISA. We then evaluated the Svanovir-ELISA for the detection of bulk milk samples on the basis of the current paratuberculosis prevalence within 69 dairy herds from Rhineland-Palatinate using individual milk samples. When the bulk milk samples were tested in two different laboratories using the same ELISA, considerable differences in the results became evident. Nearly all samples were tested with a higher relative test result in one laboratory, which often led to differences in the classification of the prevalence levels.The estimated within-herd seroprevalences ranged between 0 % and 37 %.There was little agreement between the historica paratuberculosis herd Status and the within-herd prevalence in milk serum, as reflected in a kappa-index of 0.146.To determine the sensitivity and specificity of the bulk milk ELISA by ROC and TG-ROC analysis, 116 bulk milk samples were used that had been obtained from the 69 dairy herds participating in the study.The optimal ratio of sensitivity (81 %) and specificity (77 %) relative to a “gold stan-dard”was obtained when the cut-off was set at the 10 % level.These values for sensitivity and specificity were better than those obtained in an evaluation of the same ELISA in which the historical Paratuberculosis herd-status was used as a “gold Standard" The results of this study guestion the suitability of the available ELISAs for bulk milk testing.Taking into account that the Svanovir-ELISA for individual milk samples has a sensitivity of 60 % relative to the blood serum variant of the test, and that the latter has also a limited sensitivity due to the pathogenesis of paratuberculosis, the available test Systems examined in this Study do not seem to be suita-ble for herd diagnosis by using bulk milk samples.
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