Charakterisierung der Interaktion porciner Spermien mit uterinen Epithelzellen und der hiermit verbundenen Genexpression hinsichtlich der Modulation einer erfolgreichen Insemination

Die künstliche Besamung des Schweines hat in den letzten 20 Jahren weltweit zunehmend an Bedeutung gewonnen. Durch Optimierung des Besamungsmanagements gelingt eine hohe Fertilitätsrate von nahezu 90%. Allerdings werden hierfür Besamungsportionen mit mindestens 1 x 109 Spermien benötigt, wodurch der effiziente Einsatz von Besamungsebern eingeschränkt wird. Dieser Umstand limitiert auch die Etablierung neuer biotechnischer Verfahren in der Schweinereproduktion, hervorzuheben ist die geschlechtsspezifische Sortierung von Spermien anhand der Geschlechtschromosomen mittels Durchflusszytometrie. Um die benötigte Spermienzahl pro Besamungsportion senken zu können, muss auf aufwendige Techniken wie tief intrauterine Besamung und laparoskopische Eileiterbesamung zurückgegriffen werden, da bei diesen Verfahren die durch die Uteruspassage bedingte Verluste vermieden werden können. Damit die künstliche Besamung mit einer reduzierten Spermienkonzentration innerhalb der konventionellen Besamungstechniken erfolgreich durchgeführt werden kann, müssen daher grundlegende uterine Mechanismen der Spermienselektion aufgezeigt werden. Ziel dieser Arbeit war es, anhand eines besseren Verständnisses sowohl der uterinen Spermienretentionsmechanismen als auch der immunologischen Reaktionen im porcinen Uterus neue Möglichkeiten für die Optimierung des Besamungsmanagements beim Schwein aufzuzeigen. Demzufolge wurden die nachstehend genannten Hypothesen aufgestellt: 1. Die Retention von Spermien im Uterus wird durch die Bindung von Spermien an das uterine Epithelzellgewebe bedingt. 2. Die Spermien-Epithelzellbindung im Uterus wird durch Seminalplasma moduliert. 3. Die Bindung von Spermien an uterine Epithelzellen beeinflusst die Genexpression im Uterus und hat dadurch Auswirkungen auf spätere Ereignisse wie Implantation und Embryonalentwicklung. In einem ersten in-vivo-Versuch wurden präovulatorischen Jungsauen eine von 5 verschiedene Inseminatvarianten intrauterin appliziert: PBS allein (PBS); Seminalplasma allein (SP); Nebenhodenschwanzsperma in PBS (NHS); Spermien in PBS (PBSSp); Spermien in Seminalplasma (SPSp). Das Inseminat hatte dabei jeweils ein Volumen von 80 ml und enthielt gegebenenfalls 3 x109 Spermien. Eine unbesamte Negativkontrolle (NC) vervollständigte die Untersuchungsgruppen. Zwei Stunden nach Behandlung wurden die Tiere geschlachtet und der Reproduktionstrakt entfernt. Auf die Spülung eines der beiden Uterushörner mit 20 ml einer PBS-Lösung folgte die Aufbereitung von Gewebeproben zur Herstellung histologischer Schnitte und einer anschließenden Präparation des uterinen Epithelzellgewebes zur Gewinnung von RNA für Genexpressionsstudien. Das zweite Uterushorn diente einer Gramfärbung zum Ausschluss symptomloser Infektionen. Die aus dem Uterus gewonnene Spülfüssigkeit wurde hinsichtlich der Quantität rückgespülter Spermien und Leukozyten untersucht. Die geringsten Mengen der in das Uteruslumen eingewanderter Leukozyten sowie die größte Anzahl an rückgespülten Spermien konnten in der Untersuchungsgruppen SPSp gezählt werden. Die RNA-Proben wurden mittels eines speziell gefertigten Mikroarray-Chips auf die Expression von 349 immunrelevanten Genen untersucht. Der Gruppenvergleich NC versus SPSp ergaben mit 15 die meisten der differentiell regulierten Gene. Die in dieser Gruppe regulierten Gene CD163 und PPAR-alpha wurden nachfolgend mittels immunhistologischen Untersuchungen näher untersucht. Der Nachweis von CD163-Protein gelang, jedoch wurden keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der detektierten Menge an CD163 im uterinen Epithelzellgewebe festgestellt. Für PPAR-alpha konnte keine Expression im uterinen Epithelzellgewebe ermittelt werden. Die Validierung der Mikroarray Ergebnisse mittels Real-time PCR zeigte weitgehende Übereinstimmungen. In einem zweiten Besamungsversuch wurde die Zeitkinetik der uterinen Immunantwort untersucht. Nach Instillation von entweder PBS allein oder Spermien in Seminalplasma in präpuberale Jungsauen wurde der Reproduktionstrakt zu verschiedenen Zeitpunkten (15 min, 2h und 6h nach Besamung, sowie zum Zeitpunkt der Ovulation) chirurgisch entfernt. Die weiteren Untersuchungen wurden gemäß dem ersten In-vivo-Versuch durchgeführt. Wie im ersten Versuchsabschnitt fanden sich hierbei im Gruppenvergleich NC versus SPSp mit 17 die meisten differentiell regulierten Gene, allerdings zeitverschoben zu 6 Stunden nach der Besamung. Ausserdem zeigte es sich, dass zum Zeitpunkt der Ovulation jegliche immunologische Reaktion des Uterus abgeschlossen war. Zusammenfassend lässt sich aus den Ergebnissen der hier vorliegenden Arbeit schließen: Die Besamungsportionen, welche sowohl Spermien als auch Seminalplasma enthielten, also den Komponenten des Eberejakulates im Natursprung entsprachen, wiesen den geringsten Anteil ins Uteruslumen eingewanderter Leukozyten auf, bei gleichzeitig vergleichsweise hoher Rate rückgespülter Spermien. Darüber hinaus konnte in beiden Versuchsabschnitten gezeigt werden, dass es bei Kontakt des Uterusepithels mit Spermien und Seminalplasma in Kombination zu einer signifikanten Änderung im Genexpressionsmusters im Vergleich mit der Negativkontrolle kommt. Dieses verdeutlicht und unterstreicht die These, dass die Kombination aus Spermien und Seminalplasma einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Modulation der porcinen, uterinen Immunantwort hat. Es ist zu vermuten, dass die Einflussnahme auf die uterine Genexpression durch Seminalplasma-vermittelte Bindung der Spermien an das Uterusepithel erfolgt, auch wenn der eigentliche Beweis für diese Bindung noch aussteht. Diese Bindung könnte auch einen Teil der Verantwortung für die hohen uterinen Spermienverluste tragen. Ein weiterer interessanter Befund dieser Studie ist, dass jegliche Änderungen in der Genexpression zum Zeitpunkt der Ovulation nicht mehr nachweisbar sind. Derzeit laufende in-vitro Untersuchungen haben zum Ziel die Spermien-Epithelzellbindung direkt nachzuweisen und den Bindungsmechanismus zu entschlüsseln.