Targeted genetic modification of the porcine genome using zinc-finger nucleases

Zinkfinger-Nukleasen (ZFNn) sind künstlich generierte “molekulare Scheren”, die permanente genetische Veränderungen an einer spezifischen Stelle im Genom induzieren. Das Schneiden der DNA durch die Nukleasen führt zur Aktivierung eines fehleranfälligen Reparaturmechanismus der Zelle („nicht-homologe End-Verknüpfung“), wodurch eine Mutation in der Basenabfolge der DNA Sequenz entstehen kann. Ist die Mutation ausreichend groß oder führt sie zu einer Leseraster Verschiebung, kann dies zu einem funktionellen „Gen-Knockout“ (KO) führen. Für die Generierung gezielter Modifikationen im Genom ist die ZFN-Methode wesentlich effizienter als konventionelle Methoden, wie z.B. homologe Rekombination (HR). ZFNn wurden bereits erfolgreich in verschiedenen Organismen angewendet, wie z.B. Insekten, Amphibien, Pflanzen, Nematoden, und verschiedene Säugetiere, wie der Mensch. Im Rahmen dieser Studie wird der erste „biallelische Gen-Knockout“ eines endogenen Schweinegens mittels Zinkfinger-Nukleasen dargestellt. Der „Knockout“ des α1,3-Galaktosyltransferase (GGTA1, Gal) Gens ist Voraussetzung für die Verwendung von Schweinen im Rahmen der Xenotransplantation (Transplantation von Organen vom Schwein zum Menschen). Transplantationen zwischen verschiedenen Arten, wie Schwein und Pavian, führen zu einer hyperakuten Abstoßungsreaktion (HAR). Grund dafür sind die sogenannten Gal-Epitope, welche sich auf der Zelloberfläche von Schweinezellen und Gewebe befinden. Dem Menschen und Altweltaffen fehlen evolutionsbedingt diese Zuckermoleküle auf der Zelloberfläche. Stattdessen weisen sie Antikörper gegen die Gal-Epitope auf, welche bei einer Xenotransplantation das Schweinegewebe angreifen und dessen Zerstörung induziert. Das Überleben der Organe im Empfänger Organismus kann verlängert werden, indem das GGTA1-Gen ausgeschaltet wird, welches für die Generierung der Gal-Epitope verantwortlich ist. Gal-negative Schweine wurden bereits von anderen Gruppen produziert, allerdings mit der konventionellen HR Methode. Die ZFN-Methode hat mehrere Vorteile: wegen ihrer hohen Effizienz ist es möglich innerhalb eines Experimentes beide Gene auszuschalten, zudem ist keine Antibiotika Selektion notwendig. Die zufällige Integration von fremder DNA in das Genom mittels HR kann zu schädlichen genetischen Veränderungen führen. Dieses Risiko ist im Falle der ZFN-vermittelten Modifikationsmethode drastisch minimiert. Ein eventueller negativer Nebeneffekt der ZFNn könnte die Induktion von unerwünschten Mutationen im Genom sein, die allerdings nur selten vorkommen. Die folgende Doktorarbeit beschreibt den Weg von fetalen „Wildtyp“ Schweinefibroblasten hin zu „biallelischen“ ZFN-vermittelten GGTA1 „Knockout“ Schweinen. Die ZFN-vermittelte Genmodifikation von Schweinefibroblasten ergab eine maximale Effizienz von 1% im Falle des biallelischen GGTA1 „Knockouts“. Die Gal-negativen Zellen wurden mit Hilfe magnetischer „Beads“ angereichert, was mit >95%iger Reinheit gelang. Die Gal-negativen Zellen wurden für den somatischen Zellkerntransfer eingesetzt, um einerseits Feten für erste Analysen, und andererseits lebende Gal-negative Schweine zu produzieren. Zellen der modifizierten Feten und Schweine wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert, es konnten keine Gal-Epitope nachgewiesen werden. Eine „Komplement-Lysis-Prüfung“ wies einen Schutz der ZFN-vermittelten „Knockout“ Zellen vor der Lyse auf. Dieser war dem Schutze der konventionell erzeugten HR-GGTA1-KO Zellen ähnlich. Sequenz Analysen ergaben, dass die ZFN-vermittelten genetischen Veränderungen in der DNA Sequenz meist aus kleinen Deletionen (1 bis 7 bp), wenigen Insertionen (4 bp) und einer großen Deletion von 96 Basenpaaren bestanden. Die meisten Feten und Schweine hatten unterschiedliche Mutationen auf beiden Allelen (heterozygote Mutation), nur drei von elf „Haplotypen“ wiesen die gleiche Mutation auf beiden Allelen (homozygote Mutation) auf. Negative Nebeneffekte der ZFN-vermittelten Genmodifikation, wie z.B. Plasmid-DNA Integration in das Schweinegenom oder unerwünschte Mutationen an anderen Genorten, konnten nicht detektiert werden. Weibliche und männliche Gal-negative Schweine wurden mit Hilfe der ZFN-vermittelten Genmodifikation und des somatischen Zellkerntransfers erstellt. Diese Methode ist effizienter als herkömmliche konventionelle genetische Modifikationsmethoden (HR). Negativen Effekte oder Geschlechtsspezifische Unterschiede wurden nicht festgestellt. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass sich ZFNn als gezielte Modifikationsmethode im domestizierten Schwein eignen, um transgene Schweine zu erstellen, welche sich für Xenotransplantation oder als Krankheitsmodelle eignen.