Entwicklung und Validierung einer immuno-RT-PCR zur Detektion von bovinem Osteocalcin

Die Verfütterung tierischer Proteine an Nutztiere ist seit 2001 [1] bis auf wenige strengdefinierte Ausnahmen wie z.B. die Verfütterung von Fischmehl an Schweine und Geflügel, der Zusatz von Fischmehl in Milchersatzfutter für junge Wiederkäuer sowie die unbeabsichtigte und unvermeidbare Kontamination mit Knochensplittern in pflanzlichen Futtermitteln verboten. Die offizielle Methode zum Nachweis tierischer Bestandteile in Futtermitteln beruht derzeitig auf der Mikroskopie [2]; diese erlaubt jedoch nicht die Differenzierung von Tierarten. Ziel unserer Arbeit ist die Entwicklung einer sensitiven Methode, welche die Vorteile immunologischer Verfahren (einfache Durchführbarkeit ohne größeren speziellen Aufwand) mit denen der RT-PCR (hohe Sensitivität) vereint. Als Target dient bovines Osteocalcin - ein ~ 5,8 kDa [3] großes Osteoblastenprodukt, welches einerseits extrem hitzestabil, andererseits hochkonservativ im Mittelbereich und speziesvariabel am N- und C-terminalen Ende ist und somit optimal für den speziesspezifischen Nachweis tierischer Proteine in prozessierten Futtermitteln geeignet ist. Die immuno-RT-PCR basiert auf einem Sandwich-ELISA-System, wobei der mit Streptavidin markierte Detektionsantikörper gegen bovines Osteocalcin gerichtet ist und eine Kopplungsstelle für die mit Biotin gelabelte DNA aufweist. Die Validierung des entwickelten Verfahrens zeigt eine Sensitivität von 10 ppm bovinem Osteocalcin und erlaubt somit auch dessen Nachweis in stark prozessiertem Fleisch- und Knochenmehl (FKM). Dies konnte an ausgewählten Futtermitteln mit definierten Beimischungen von bovinem FKM in dem Konzentrationsbereich von 0,1-10 % gezeigt werden.