Nachweis von Clostridium botulinum Neurotoxin in Rinderkot und Silage - Empfehlungen zur Durchführung des Maus-Bioassays

Bundesweit führen nur wenige Laboratorien die veterinärmedizinische Botulismus-Diagnostik durch, hierbei ist der Nachweis von Clostridium botulinum Neurotoxin (BoNT) ein entscheidender Bestandteil der Laboruntersuchungen. Bisher sind sieben serologisch unterscheidbare Typen (A-G) von Botulinum-Neurotoxinen bekannt, die sich aufgrund ihrer genetischen und/oder antigenen Eigenschaften in mindestens 35 Subtypen unterscheiden lassen. Im Zusammenhang mit einer ätiologisch ungeklärten Erkrankung bei Rindern, die mit einem schleichenden Verfall einhergeht und ganze Rinderbestände betreffen kann, wird als mögliche Ursache des Krankheitsbildes die Produktion von Neurotoxin durch Clostridium (C.) botulinum im Darm der betroffenen Rinder mit anschließender Resorption geringer Mengen diskutiert. Bisherige Untersuchungsergebnisse verschiedener Laboratorien wiesen Divergenzen beim Nachweis von Clostridium botulinum Neurotoxin auf, die zu kontroversen Diskussionen führten. Eine zuverlässige Diagnostik des Botulismus in Hinblick auf den Nachweis vonC. botulinum Neurotoxin und C. botulinum Sporen oder lebenden Bakterien ist die Grundvoraussetzung für eine sachliche, fundierte Diskussion. Aus diesem Grund führte das Friedrich-Loeffler-Institut im Auftrag des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz (BMELV) eine Vergleichsuntersuchung zur Botulismusdiagnostik in Deutschland durch, an der sich verschiedene Laboreinrichtungen beteiligt haben. Die Ergebnisse fi elen sehr unterschiedlich aus, sodass erheblicher Verbesserungsbedarf im Bereich der Qualität der Labordiagnostik festgestellt wurde. In der Folge des Projektes wurde die hier vorliegende Durchführungsempfehlung für den Nachweis von C. botulinum Neurotoxin mittels des Maus-Bioassays entwickelt. Ein entscheidender Schritt in der Botulismusdiagnostik ist zunächst die Untersuchung der Proben auf Toxizität im Maus-Bioassay. Werden hier Hinweise auf das Vorliegen von C. botulinum Neurotoxin erhalten, sollten sich weitere Untersuchungen zur Typisierung des Toxins mit entsprechenden Antiseren anschließen, da der eindeutige Nachweis von C. botulinum Neurotoxin die Neutralisation (Typisierung) der festgestellten Toxizität mit entsprechenden Antiseren im Maus-Bioassay erfordert. Die Neutralisation ist nicht Gegenstand dieser Empfehlung, da die durch die Vergleichsuntersuchung aufgedeckten diagnostischen Schwierigkeiten zunächst die Feststellung von Toxizität (durch C. botulinum Neurotoxin) im Maus-Bioassay betreffen. Die unter 11. dieser Methodenempfehlung angegebenen Literaturstellen enthalten Protokolle zur Durchführung der Neutralisation. In der Laborvergleichsuntersuchung wurde der Nachweis von C. botulinum Neurotoxin aus Rinderkot und Silage untersucht. Bei der Herstellung der dotierten Proben aus Rinderkot und Silage wurde das Probenmaterial mit Gelatine-Phospat-Puffer vermischt, daher waren alle Proben der Vergleichsuntersuchung im Bezug auf die Matrix verdünnt. Die Basis der vorliegenden Methodenempfehlung ist der Vergleich der Durchführung des Maus-Bioassays in den teilnehmenden Laboren. Die Empfehlung resultiert aus den Ergebnissender Vergleichsuntersuchung, den Erfahrungen der Laboratorien und der daraus folgenden Einschätzung zu unterschiedlichen methodischen Vorgehensweisen. In der Methodenempfehlung sind alternative Varianten aufgeführt, wenn diese als annähernd gleichwertig betrachtet wurden. Der Nachweis von vegetativen Zellen oder Sporen von C. botulinum sowie die Typisierung von C. botulinum Neurotoxin ist nicht Gegenstand dieser Empfehlung.