Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen mit dem Verfahren der Bouillon-Mikrodilution bei pathogenen Bakterien von Fischen und molekulare Charakterisierung von Resistenzgenen

Im Zeitraum 2004-2006 wurden im Rahmen des Nationalen Resistenzmonitorings GERM-Vet erstmals fischpathogene Bakterien aus Deutschland auf ihre Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Wirkstoffen untersucht. Insgesamt wurden 206 Isolate von Nutz- und Zierfischen gesammelt und in die vorliegende Studie einbezogen. Die Empfindlichkeitsprüfung erfolgte mittels Bouillon-Mikrodilution gemäß dem CLSI-Dokument M49-A. Die Isolate wurden bei einer Inkubationstemperatur von 22 ± 2°C auf ihre In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber 22 Wirkstoffen und 2 Wirkstoffkombinationen überprüft. Die Untersuchungsgruppe setzte sich aus 173 beweglichen Aeromonas spp.-Isolaten, 13 Aeromonas salmonicida-Isolaten sowie 20 Yersinia ruckeri-Isolaten zusammen. Bis auf die Aeromonas spp., von denen ein Großteil der Isolate aus dem Zierfischbereich stammte, konnten die anderen Spezies bei Nutzfischen isoliert werden. Für 44 Aeromonas spp.-Isolate, die aufgrund auffällig hoher MHK-Werte gegenüber bestimmten Wirkstoffen weiter molekulargenetisch untersucht wurden, erfolgte eine Speziesbestimmung über die Sequenzierung eines Teils des gyrB-Gens. Die 44 Isolate umfassten 19 A. hydrophila-Isolate [Hybridisierungsgruppe 1 (HG1)], 15 A. veronii biovar sobria-Isolate (HG8), fünf A. veronii biovar veronii-Isolate (HG10), je zwei A. sobria- (HG7) und A. bestiarum-Isolate (HG2) sowie ein A. caviae-Isolat (HG4). In Deutschland ist für die Therapie bakterieller Infektionen nur die Wirkstoffkombination Trimethoprim/Sulfamethoxazol (1:19; SXT) zugelassen. Gegenüber dieser Wirkstoffkombination wiesen 30 Aeromonas spp.- und zwei A. salmonicida-Isolate MHK-Werte von >32/608mg/L auf. Bei allen 32 Isolaten wurde das Sulfonamid-Resistenzgen sul1 durch eine PCR nachgewiesen. Bei 27 Isolaten (25 Aeromonas spp.- und zwei A. salmonicida-Isolate) konnten je ein und bei vier Aeromonas spp.-Isolaten je zwei Klasse 1 Integrons nachgewiesen werden. Innerhalb der Klasse 1 Integrons wurden sieben verschiedene Genkassetten mit den Trimethoprim-Resistenzgenen dfrA1, dfrA12, dfrA14, dfrA28, dfrB1, dfrB3 oder dfrB4 durch Sequenzanalysen bestätigt. Bei drei SXT-resistenten Aeromonas spp.-Isolaten wurde das Trimethoprim-Resistenzgen dfrA1 per PCR außerhalb eines Klasse 1 Integrons nachgewiesen. Zwei dieser Isolate verfügten aber über Klasse 1 Integrons mit anderen Genkassetten. Es wurden insgesamt 12 verschiedene Genkassetten-Arrangements detektiert: dfrA28-orfV (n=1), dfrA12-orfF (n=1), orf-aadA5 (n=1), dfrB3-aadA1 (n=1), dfrA1-aadA1 (n=4), dfrA14-rekombinantes aadA6 (n=1), catB3-aadA2 (n=3), dfrA12-orfF-aadA2 (n=18), dfrB4-catB3-aadA1 (n=1), dfrB1-aadA1-catB2 (n=2), dfrA12-orfF mit integriertem IS630-aadA2 (n=1) sowie arr-3-aacA4-blaOXA-10-aadA1 (n=1). Jedoch konnten auch gegenüber anderen antimikrobiellen Wirkstoffen z. T. hohe MHK-Werte festgestellt werden. Gegenüber dem Aminocyclitol Apramycin zeigten acht Aeromonas spp.-Isolate einen im Vergleich zu den restlichen Isolaten deutlich erhöhten MHK-Wert von ≥ 64 mg/L. Mittels PCR wurde bei sieben der acht Isolate das Apramycin-Resistenzgen aac(3´)-IV nachgewiesen. Elf Aeromonas spp.-Isolate zeigten deutlich erhöhte MHK-Werte von ≥ 256 mg/L gegenüber Chloramphenicol (aber niedrige MHK-Werte von 1 – 4 mg/L gegenüber Florfenicol) und verfügten über ein catA2-Gen; zwei A. salmonicida-Isolate mit MHK-Werten von 64 mg/L waren hingegen negativ in der PCR für die Resistenzgene catA1, catA2, catA3, cmlA/cmlB und oqxAB. Weitere 13 Aeromonas spp.-Isolate wiesen erhöhte MHK-Werte von 16 bis > 64 mg/L für Florfenicol auf. Bei allen Isolaten wurde das Resistenzgen floR mittels PCR nachgewiesen. Sieben dieser Isolate besaßen das Resistenzgen catA2 und zeigten MHK-Werte für Chloramphenicol von ≥ 128mg/L. In die Untersuchung auf die Tetracyclin-Resistenzgene tet(A)-(E) und tet(Y) wurden alle Aeromonas spp.-Isolate mit MHK-Werten für Tetracyclin von ³ 1 mg/L aufgenommen. Am häufigsten wurde das Resistenzgen tet(E) (n=64) nachgewiesen. Das Resistenzgen tet(A) wurde bei 13 Isolaten gefunden. Weiterhin konnte tet(C) bei drei Isolaten und tet(D) bei einem Isolat detektiert werden. Bei einigen Isolaten wurden zwei tet-Gene nachgewiesen: tet(A) + (E) bei vier Isolaten, tet(C) + (E) und tet(D) + (E) bei zwei Isolaten sowie tet(C) + (Y) bei einem Isolat. Von den vier untersuchten A. salmonicida-Isolaten mit MHK-Werten von 8 oder 16 mg/L besaßen zwei Isolate das Resistenzgen tet(E), ein Isolat das Resistenzgen tet(A) und ein Isolat das Resistenzgen tet(C). Mit dieser Arbeit liegen jetzt erstmals objektive und vergleichbare Daten über die In-vitro-Empfindlichkeit pathogener Bakterien von Fischen in Deutschland sowie über die Resistenzgene und Resistenzmechanismen gegenüber ausgewählten antimikrobiellen Wirkstoffen vor. Die Assoziation von Sulfonamid/Trimethoprim-Resistenz mit Klasse 1 Integrons, die zum Teil auch Genkassetten für andere Resistenzeigenschaften tragen, birgt die Gefahr der Co-Selektion anderer Resistenzeigenschaften beim Einsatz von Sulfonamid/Trimethoprim-Kombinationen.