Transgene Expression durch zytoplasmatische Injektion von Plasmiden und Transposon-basierten Konstrukten in Säugerembryonen (Dissertation)
Genetically modified animals play an important role as biomedical models and will have a considerable impact on agricultural production in the future. However, at the moment the use of transgenic animals is limited due to inefficient and expensive process. The aim of this study was to enhance the production of transgenic animals using cytoplasmic plasmid injection. In the first part of the work the expression of human telomerase in bovine blastocysts was investigated. Due to cytoplasmic injection of telomerase encoding plasmids the expression of human telomerase protein was induced, which resulted in significantly elongated telomeres. Since in the telomerase experiments the plasmids were not integrated in the genome, transgenesis was limited to approximately 7-14 days. Nevertheless, it did show how efficient injected plasmids are transcribed and translated. In the second part of the work the focus was to resolve the limitation of transient transgenesis. Therefore, cytoplasmic plasmid injection was combined with a non-autonomous transposon system. In a pilot project stable transgenic mice with a reporter transgen were produced. The transgen was integrated with specific transposition as a single copy. Subsequently, the transposon injection experiments were applied to pig zygotes. Transposon transgenic pigs were produced with high efficiency (42-57%). They show germline transmission and segregation of transposon transgene. It was possible to localise the transposon mediated transgene within the genome exactly and a Cre-recombinase exchange of the transgenic cassette against a functional transgene is possible. This approach allows a highly efficient production of transgene farm animals combined with a targeted integration of transgenes
Genetisch modifizierte Nutztiere haben eine wesentliche Bedeutung als biomedizinische Modelle und werden zukünftig auch in der landwirtschaftlichen Produktion eine Rolle spielen. Allerdings ist die Nutzung transgener Nutztiere z.Z. wegen der geringen Effizienz und wegen der Kosten der Transgenese limitiert. In dieser Arbeit wurde mit der zytoplasmatischen Plasmidinjektion an einer Verbesserung der Produktion transgener Tiere gearbeitet. Im ersten Teil der Arbeit wurde humane Telomerase in Rinderblastozysten exprimiert. Durch die zytoplasmatische Injektion von Telomerase-kodierenden Plasmiden konnte die Expression des humanen Telomerase-Proteins induziert und eine signifikante Verlängerung der Telomeren erzielt werden. Da die verwendeten Plasmide nicht in das Genom integrierten, kam es bei den Telomerase-Versuchen zu einer zeitlich begrenzten Transgenese, die ca. 7-14 Tage anhielt. Es konnte gezeigt werden, wie effizient die injizierten Plasmide transkribiert und translatiert wurden. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Limitierung der transienten Transgenese überwunden werden, indem die zytoplasmatische Plasmidinjektion mit einem nicht-autonomen Transposon-System kombiniert wurde. Zunächst wurden in einem Pilotprojekt stabil transgene Mäuse erzeugt, die ein Reporter-Transgen durch spezifische Transposition als Einzelkopie in das Genom integriert hatten. Aufbauend auf den Vorversuchen wurden dann Transposon-Injektionsversuche in Schweinezygoten durchgeführt. Es konnten mit hoher Effizienz (42-57%) Transposon-transgene Schweine generiert werden, die eine Keimbahntransmission und Segregation der Transposon-Transgene aufwiesen. Die Transposon-Transgene können basenpaar-genau im Genom lokalisiert werden, und über die Cre-Rekombinase gegen funktionelle Transgene ausgetauscht werden. Dieser Ansatz erlaubt eine hocheffiziente Erstellung transgener Nutztiere und die gezielte Integration von Transgenen.
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