AOAC Europe International Workshop, Quality Control of Botanicals, TCM, Herbal Food Supplements and Herbal Medicinal Products

Die bovine spongiforme Enzephalopathie, auch Rinderwahnsinn genannt, wurde erstmals1986 in Großbritannien beobachtet und breitete sich in den folgenden Jahren in Europaaus. Ein Hauptübertragungsweg dieser Krankheit war vermutlich die Verfütterung vonerregerhaltigen tierischen Futtermitteln von Wiederkäuern an die pflanzenfressendenRinder. Experimentell konnte bestätigt werden, dass diese Krankheit auch auf andereSpezies, insbesondere auch den Menschen, übertragbar ist. Die Wissenschaft geht heutedavon aus, dass der Mensch durch den Verzehr von BSE-erregerhaltigen Lebensmittelnmit BSE infizierbar ist und die neue Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit auslösenkann.Um sowohl den Verbraucher, als auch die landwirtschaftlichen Nutztiere vor einer BSEInfektionzu schützen, wurde 2001 europarechtlich ein Verbot zur Verfütterung vonTiermehl erlassen. Aufgrund der rückläufigen BSE-Fallzahlen (2001: 125 infizierte Tiere;2009: 2 BSE-Fälle [BMELV]) wurde in den letzten Jahren das Verbot gelockert, sodasseinige Tiermehle (z.B. Fischmehl oder Blutmehl von Nicht-Wiederkäuern) wieder andiverse Spezies verfüttert werden dürfen. In Anbetracht dessen ist eine Methode zurUnterscheidung von Tiermehlen verschiedener Spezies von immenser Bedeutung,einerseits zur Einhaltung der lebensmittelrechtlichen Rahmenbedingungen, andererseits umeine Infektion und mögliche zukünftige Verbreitung von BSE zu verhindern.Neben der europarechtlich festgelegten mikroskopischen Analysemethode zurUntersuchung von Futtermitteln [Verordnung (EG) 152/2009], wurden weitere Methodenu.a. mit der Polymerasekettenreaktion oder Immunoassay zur Tiermehlunterscheidungentwickelt. Allerdings ist keine dieser Methoden sensitiv und selektiv genug, um zwischenallen Spezies unterscheiden zu können.Ziel dieser Diplomarbeit war es eine Methode zur Tierartidentifizierung in Tiermehlmittels Elektrosprayionisation und hochauslösender Hybrid-Massenspektrometrie (ESIqTOF-MS) zu etablieren. Anhand des Markerproteins Osteocalcin sollte aufgrund dessenvariabler Aminosäuresequenz eine speziesspezifische Identifizierung möglich sein. UnterBerücksichtigung der EG-Verordnung 999/2001, in der festgelegt ist, dass die Tiermehlewährend der Verarbeitung auf mindestens 133 °C (3 bar, 20 Minuten) erhitzt werden,wurden Tiermehlproben mit einer unterschiedlichen Sterilisationstemperatur (133 °C bis141 °C) der Spezies Rind, Schwein und Huhn untersucht.Die Probenaufarbeitung (Festphasenextraktion mit ZipTip-C18-Pipettenspitzen undzweidimensionale Hochdruckflüssigchromatographie), sowie die Analyse mit einemMALDI-TOF-MS als Screening-Methode wurden gemäß dem Protokoll von Balizs et al.[2010] durchgeführt. Da die alleinige Aufreinigung der Tiermehlproben mit derFestphasenextraktion nicht ausreichend war, wurde für die Analyse mit dem ESI-qTOFMSdie zweidimensionale HPLC als Probenaufarbeitung verwendet. Für dieIdentifizierung des Osteocalcins in den trypsinierten Probenlösungen war eine Kopplungeiner nano-HPLC an ein hochauflösendes Hybrid-Massenspektrometer besonders geeignet.Die Trennung der Peptide des Osteocalcins erfolgte mit einer Reversed-Phase-Chromatographie basierend auf Gradientenelution und der vorherigen Anreicherung miteiner Vorsäule. Die eluierten Peptide wurden im Anschluss massenspektrometrischanalysiert und identifiziert.Mit Hilfe dieser Methode konnte eine Identifizierung des Osteocalcins bis zu einerProzessierungstemperatur <141 °C anhand des spezifischen Peptids 1-19(dreifachgeladen), und den unspezifischen Peptiden AS 20-43 und AS 21-44 (drei- undvierfachgeladen) des trypsinierten Osteocalcins in bovinen und porcinen Tiermehlgewährleisten werden. Das trypsinierte Osteocalcin in der avianen Tiermehlprobe konnteanhand der Peptide AS 45-49, AS 1-20 (dreifachgeladen), AS 21-44 (drei- undvierfachgeladen), AS 21-43 (dreifachgeladen) nachgewiesen werden.In den hocherhitzten Tiermehlen war es trotz diverser Optimierungsansätze wie einezusätzliche 30 kDa Ultrazentrifugation während der Probenaufarbeitung und eineFiltrierung der Probenlösung nicht möglich Osteocalcin zu detektieren. Dies könnte mit derDegradation des Osteocalcins und hohen Kollagengehalt der Tiermehlproben begründetwerden. Weiterhin könnte das Alter der Tiere, welche für die Tiermehlherstellungverwendet wurden, eine Rolle spielen. Jungtiere weisen nur geringeOsteocalcinkonzentrationen in den Knochen auf, was eine Detektion des Osteocalcins indem möglicherweise daraus hergestellten Tiermehl erschwerte.Zukünftig können auch Tiermehle anderer Spezies mit unterschiedlichenProzessierungstemperaturen verschiedener Hersteller mit dieser Methode analysiertwerden. Weiterhin besteht die Möglichkeit den Osteocalcin-Gehalt in dem Tiermehl zuquantifizieren.