Entwicklung eines CYP3A4-abhängigen Reportergenassays

Die Cytochrom-P450-Monoxygenase 3A4 (CYP3A4) gehört zu den wichtigsten fremdstoffmetabolisierenden Enzymen im menschlichen Organismus. Die Aktivität des Enzyms kann über die Steigerung der Genexpression oder über die Inhibierung der katalytischen Aktivität durch verschiedene Xenobiotika beeinflusst werden. Aufgrund der zentralen Stellung der CYP3A4 im Fremdstoffmetabolismus kann es daher zu unvorgesehenen Interaktionen zwischen verschiedenen Medikamenten und Xenobiotika kommen. Um ein schnelles und wirkungsbezogenes Screening von potentiellen CYP3A4-Induktoren zu ermöglichen wurde ein CYP3A4-anhängiger Reportergenassay entwickelt. Dazu wurden zwei proximale Promotorfragmente (Proximal 1 und 2) und ein distales Promotorfragment (XREM) des CYP3A4-Gens in fünf verschiedenen Kombinationen vor das Reportergen Firefly-Luciferase kloniert. Die einzelnen Reportergenplasmide wurden zusammen mit einem Expressionsplasmid für den humanen nukleären Rezeptor PXR und einem Kontrollvektor, der ein zweites Reportergen exprimiert, transient in HepG2- oder HEK-293T-Zellentransfiziert. Nach Induktion durch den bekannten CYP3A4-Induktor Rifampicin zeigte das Plasmid pGL4.14-XP2-CYP3A4 die stärkste transkriptionelle Aktivierung in HepG2-Zellen. Dieses Plasmid kombiniert die Fragmente Proximal 2 und XREM und wurde als CYP3A4-abhängiges Reportergenplasmid etabliert. Der Reportergenassay wurde in Hinsicht auf die Transfektion der HepG2-Zellen, der Plasmidmengen, der Zellzahl, der Inkubationszeit und -konzentration der Positivkontrolle Rifampicin und der Wahl des Kontrollplasmides optimiert. Die maximalen Induktionen duch Rifampicin lagen nach Normierung auf das konstitutiv exprimierte Reportergen Renilla-Luciferase zwischen 5-fach und 15-fach im Vergleich zur Lösungsmittelkontrolle DMSO. Die Detektionsgrenze für Rifampicin lag bei 100 nM. Der Reportergenassay wurde durch die Analyse der bekannten CYP3A4-Induktoren Mevastatin, Mifepriston, Nifedipin, Clotrimazol und Omeprazol verifiziert. Die Ergebnisse konnten auf mRNA-Ebene für alle Induktoren bis auf Omeprazol bestätigt werden. Eine Inhibierung der Rifampicin-induzierten Firefly-Luciferase-Genexpression im Reportergenassay konnte nur durch Ketoconazol, nicht jedoch durch die CYP3A4-Inhibitoren Clarithromycin und Itraconazol erreicht werden. Ketoconazol scheint also neben der katalytischen Aktivität auch die transkriptionelle Aktivierung der CYP3A4 zu inhibieren. Beim Screening verschiedener Testsubstanzen auf ihr Potential zur CYP3A4-Induktion, konnte erstmals gezeigt werden, dass polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzo[c]phenanthren, Benzo[a]pyren und Benzo[k]fluoranthen sowie deren Metaboliten 3,4-Dihydroxy-3,4-dihydrobenzo[c]phenanthren und 7,8-Dihydroxy-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren die CYP3A4 transkriptionell aktivieren. Darüber hinaus konnte die CYP3A4-Induktion durch Quercetin bestätigt werden. Das Schistosomizid Oltipraz wurde ebenfalls als neuer CYP3A4-Induktor identifiziert. Dagegen scheint das marine Biotoxin Okadasäure ein potentieller Inhibitor der CYP3A4-Genexpression zu sein. Allerdings bedarf es hierfür weiterer Analysen. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, dass der in dieser Arbeit entwickelte CYP3A4-abhängige Reportergenassay für das Screening potentieller CYP3A4-Induktoren geeignet und einsatzbereit ist.