Untersuchung von Abwasserproben auf Gentoxizität. Ergebnisse eines Ringversuchs mit dem in vitro - Mikrokerntest im Rahmen der Standardisierung nach ISO

Ziel und Hintergrund Im Zuge der internationalen Standardisierung des in vitro-Mikrokerntests mit V79-Zellen für die Untersuchung und Bewertung von Wasserproben auf Gentoxizität (ISO/ DIS 21427-2) wurde unter Federführung der Bundesanstalt für Gewässerkunde (BfG) ein nationaler Ringversuch durchgeführt. Es beteiligten sich 10 Laboratorien aus der freien Wirtschaft, von Hochschulen und Behörden. Beim Mikrokerntest handelt es sich um die Testung auf eine spezielle Form von Chromosomenaberration. Um die Standardisierung des Verfahrens abschließen zu können, mussten codierte Abwasserproben in Form eines Ringtests untersucht werden. Es sollten damit die Durchführbarkeit des Verfahrens dokumentiert und Validitätsdaten erhoben werden.Material und Methoden Der Mikrokerntest wurde mit V79-Zellen, einer permanent wachsenden Zelllinie von Lungenfibroblasten des Chinesischen Hamsters durchgeführt. Es wurden vier codierte Proben von einer kommunalen und einer industriellen Kläranlage mit und ohne metabolische Aktivierung durch S9-Mix untersucht. Zwei der Proben waren im Vorfeld mit den Klastogenen Cyclophosphamid und Mitomycin C in definierten Konzentrationen aufdotiert worden.Bewertungskriterium für Gentoxizität war die Verdünnungsstufe der Probe im Test bei der keine statistisch signifikante Erhöhung der Mikrokernrate mehr auftrat (LID; 'Lowest Ineffective Dilution'). Kriterium für Zytotoxizität war der Survival-Index, also die prozentuale Wachstumsrate der Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Als zusätzliche qualitative Merkmale wurden der Mitoseindex und der Proliferationsindex der Zellen bestimmt.Ergebnisse Obwohl mehrere der teilnehmenden Labore zuvor wenig bis keinerlei praktische Erfahrung mit dem in vitro-Mikrokerntest nach dem ISO-Entwurf hatten, können die Resultate als sehr gut bezeichnet werden. Es kam zu maximal 20% ungültigen Ergebnissen. Die beiden nicht-gentoxischen Proben wurden zu 100% bzw. zu 90% als negativ erkannt. Die mit Mitomycin C dotierte Probe (Soll: positiv ohne S9-Mix) wurde von allen Laboren richtig bewertet. Bei der Cyclophosphamid-Probe (Soll: positiv mit S9-Mix) erkannten 80% der Labore die Probe korrekt als In der Nachauswertung wurde festgestellt, dass die beiden falsch-negativen Ergebnisse auf technischen, nicht aber auf methodischen Mängeln beruhten. Die Resultate schwankten bei allen Proben maximal um eine Verdünnungsstufe bezogen auf den medianen LID-Wert. Der Survival-Index zeigte sich als robustes Maß für die Zytotoxizitätsabschätzung bei der Abwassertestung.Diskussion Die Detektion von Mikrokernen ist ein häufig verwendeter Parameter für das Erkennen zytogenetischer Schäden. Der Mikrokerntest ist anders als beispielsweise die Einzelzell-Gelelektrophorese (Comet-Assay) kein Indikatortestverfahren sondern zeigt bereits Mutagenität an, da irreparable DNA-Schäden analysiert werden. Treten Mikrokerne mit erhöhter Frequenz auf, ist in nachfolgenden Zellgenerationen mit schweren genetischen Schäden zu rechnen. Im Hinblick auf einen vorbeugenden Umweltund Gesundheitsschutz bedeutet dies, dass das Untersuchungsgut (Ab) Wasserprobe keine signifikante Erhöhung der Mikrokernrate hervorrufen sollte.Schlussfolgerungen und Ausblick Beim vorliegenden Ringversuch handelt es sich um den ersten Interlaboratoriums-Vergleich des Mikrokerntests mit Abwasserproben. Das Verfahren soll als eukaryontisches Pendant die bereits nach DIN und ISO standardisierten bakteriellen Verfahren umu-Test und Ames-Test komplementieren.Die erfolgreiche Durchführung dieses Ringversuchs rechtfertigt die Überführung des ISO-Entwurfs ('Draft International Standard') in den 'Final Draft International Standard' (FDIS), die letzte Vorstufe zur internationalen Norm. Es steht damit ein valides eukaryontisches Testsystem für die Wassertestung zur Verfügung.